Sen sinais de amplificación

1.A Taq DNA Polymerase do kit perde a súa actividade debido ao almacenamento inadecuado ou a caducidade do kit.
Recomendación: confirmar as condicións de almacenamento do kit;volve engadir unha cantidade adecuada de Taq DNA Polymerase ao sistema de PCR ou mercar un novo kit de PCR en tempo real para experimentos relacionados.

2.Hai moitos inhibidores da ADN polimerase Taq no molde de ADN.
Suxestión: Repurifique o modelo ou reduza a cantidade de modelo utilizado.

3.A concentración de Mg2+ non é adecuada.
Recomendación: a concentración de Mg2+ da mestura 2× Real PCR que ofrecemos é de 3,5 mM.Non obstante, para algúns cebadores e modelos especiais, a concentración de Mg2+ pode ser maior.Polo tanto, pode engadir directamente MgCl2 para optimizar a concentración de Mg2+.Recoméndase aumentar o Mg2+ 0,5 mM cada vez para a optimización.

4.As condicións de amplificación da PCR non son axeitadas e a secuencia ou concentración do cebador é inadecuada.
Suxestión: confirmar a corrección da secuencia do cebador e que o cebador non foi degradado;se o sinal de amplificación non é bo, intente baixar a temperatura de recocido e axuste adecuadamente a concentración do cebador.

5.A cantidade de modelo é demasiado pouca ou demasiado.
Recomendación: realice a dilución do gradiente de linealización do modelo e seleccione a concentración do modelo co mellor efecto de PCR para o experimento de PCR en tempo real.

NTC ten un valor de fluorescencia demasiado alto

1.Contaminación dos reactivos causada durante a operación.
Recomendación: substituír por novos reactivos para experimentos de PCR en tempo real.

2. A contaminación produciuse durante a preparación do sistema de reacción PCR.
Recomendación: Tomar as medidas de protección necesarias durante o funcionamento, tales como: usar luvas de látex, usar unha punta de pipeta con filtro, etc.

3.Os cebadores degrádanse e a degradación dos cebadores provocará unha amplificación inespecífica.
Suxestión: use a electroforese SDS-PAGE para detectar se os cebadores están degradados e substitúeos por novos cebadores para experimentos de PCR en tempo real.

Dímero de cebador ou amplificación inespecífica

1.A concentración de Mg2+ non é adecuada.
Recomendación: a concentración de Mg2+ do 2× Real PCR EasyTM Mix que proporcionamos é de 3,5 mM.Non obstante, para algúns cebadores e modelos especiais, a concentración de Mg2+ pode ser maior.Polo tanto, pode engadir directamente MgCl2 para optimizar a concentración de Mg2+.Recoméndase aumentar o Mg2+ 0,5 mM cada vez para a optimización.

2.A temperatura de recocido da PCR é demasiado baixa.
Suxestión: Aumente a temperatura de recocido da PCR 1℃ ou 2℃ cada vez.

3.O produto PCR é demasiado longo.
Recomendación: a duración do produto de PCR en tempo real debe estar entre 100 e 150 pb, non máis de 500 pb.

4.Os cebadores degrádanse e a degradación dos cebadores levará á aparición dunha amplificación específica.
Suxestión: use a electroforese SDS-PAGE para detectar se os cebadores están degradados e substitúeos por novos cebadores para experimentos de PCR en tempo real.

5.O sistema PCR é incorrecto ou o sistema é demasiado pequeno.
Suxestión: o sistema de reacción PCR é demasiado pequeno fará que a precisión da detección diminúa.É mellor utilizar o sistema de reacción recomendado polo instrumento de PCR cuantitativa para volver executar o experimento de PCR en tempo real.

Escasa repetibilidade dos valores cuantitativos

1.O instrumento funciona mal.
Suxestión: pode haber erros entre cada orificio de PCR do instrumento, o que provoca unha reproducibilidade deficiente durante a xestión ou detección da temperatura.Comprobe segundo as instrucións do instrumento correspondente.

2.A pureza da mostra non é boa.
Recomendación: As mostras impuras provocarán unha reproducibilidade deficiente do experimento, que inclúe a pureza do molde e dos cebadores.O mellor é repurificar o modelo e os cebadores son mellor purificados mediante SDS-PAGE.

3.O tempo de preparación e almacenamento do sistema PCR é demasiado longo.
Suxestión: use o sistema de PCR en tempo real para o experimento de PCR inmediatamente despois da preparación e non o deixe de lado durante moito tempo.

4.As condicións de amplificación da PCR non son axeitadas e a secuencia ou concentración do cebador é inadecuada.
Suxestión: confirmar a corrección da secuencia do cebador e que o cebador non foi degradado;se o sinal de amplificación non é bo, intente baixar a temperatura de recocido e axuste adecuadamente a concentración do cebador.

5.O sistema PCR é incorrecto ou o sistema é demasiado pequeno.
Suxestión: o sistema de reacción PCR é demasiado pequeno fará que a precisión da detección diminúa.É mellor utilizar o sistema de reacción recomendado polo instrumento de PCR cuantitativa para volver executar o experimento de PCR en tempo real.