Explicación dos termos básicos de bioloxía molecular
1. ADNc e ADNccc: o ADNc é un ADN de dobre cadea sintetizado pola transcriptase inversa a partir do ARNm;cccDNA é un plásmido de ADN circular pechado de dobre cadea libre do cromosoma.
2. Unidade de pregamento estándar: a unidade de estrutura secundaria da proteína α-hélice e a folla β poden formar bloques estruturais con disposicións xeométricas especiais a través de varios polipéptidos de conexión.Este tipo de pregamento determinado adoita chamarse estrutura súper secundaria.Case todas as estruturas terciarias poden ser descritas por estes tipos de pregamento, e mesmo os seus tipos combinados, polo que tamén se denominan unidades de pregamento estándar.
3. CAP: proteína receptora de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) CRP (proteína receptora de AMPc), o complexo formado tras a combinación de AMPc e CRP chámase proteína activadora CAP (proteína activada por AMPc)
4. Secuencia palindrómica: a secuencia complementaria inversa dun segmento dun fragmento de ADN, moitas veces un sitio de encimas de restrición.
5. ARNm: ARN interferente complementario ou ARN antisentido, que é complementario á secuencia do ARNm e pode inhibir a tradución do ARNm.
6. Ribozima: ARN con actividade catalítica, que desempeña un papel autocatalizador no proceso de empalme do ARN.
7. Motivo: hai algunhas rexións locais con forma e topoloxía tridimensional similares na estrutura espacial das moléculas de proteínas
8. Péptido sinal: un péptido con 15-36 residuos de aminoácidos no extremo N-terminal durante a síntese de proteínas, que guía a transmembrana da proteína.
9. Atenuador: secuencia de nucleótidos entre unha rexión operadora e un xene estrutural que remata a transcrición.
10. Punto máxico: cando a bacteria crece e atopa unha completa falta de aminoácidos, as bacterias producirán unha resposta de emerxencia para deter a expresión de todos os xenes.Os sinais que xeran esta resposta de emerxencia son o tetrafosfato de guanosina (ppGpp) e o pentafosfato de guanosina (pppGpp).O papel de PpGpp e pppGpp non é só un ou algúns operóns, senón que afecta a un gran número deles, polo que se chaman superreguladores ou puntos máxicos.
11. Elemento promotor upstream: refírese á secuencia de ADN que xoga un papel regulador na actividade do promotor, como TATA na rexión -10, TGACA na rexión -35, potenciadores e atenuadores.
12. Sonda de ADN: un segmento de ADN marcado cunha secuencia coñecida, que é moi utilizado para detectar secuencias descoñecidas e cribar xenes diana.
13. Secuencia SD: é a secuencia de unión do ribosoma e do ARNm, que regula a tradución.
14. Anticorpo monoclonal: anticorpo que actúa só contra un único determinante antixénico.
15. Cósmido: é un vector de ADN exóxeno construído artificialmente que retén as rexións COS nos dous extremos do fago e está conectado ao plásmido.
16. Cribado de manchas brancas e azules: o xene LacZ (que codifica a β-galactosidase), o encima pode descompoñer o substrato cromoxénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactosido) para producir azul, facendo así a cepa azul.Cando se insire o ADN esóxeno, o xene LacZ non se pode expresar, e a cepa é branca, para filtrar as bacterias recombinantes.Isto chámase screening azul-branco.
17. Elemento de acción cis: unha secuencia específica de bases do ADN que regula a expresión xénica.
18. Enzima Klenow: fragmento grande da ADN polimerase I, excepto que a actividade exonuclease 5' 3' é eliminada do holoenzima ADN polimerase I
19. PCR ancorada: utilízase para amplificar o ADN de interese cunha secuencia coñecida nun extremo.Engadiuse unha cola poli-dG a un extremo da secuencia descoñecida, e despois utilizáronse o poli-dC e a secuencia coñecida como cebadores para a amplificación por PCR.
20. Proteína de fusión: o xene da proteína eucariota está conectado co xene esóxeno, e a proteína composta pola tradución da proteína do xene orixinal e da proteína esóxena exprésase ao mesmo tempo.
Outros termos de bioloxía molecular
1. O mapa físico do ADN é a orde na que se dispoñen os fragmentos (dixeridos por endonuclease de restrición) da molécula de ADN.
2. A escisión da RNase divídese en dous tipos (autocatálise) e (heterocatálise).
3. Hai tres factores de iniciación en procariotas son (IF-1), (IF-2) e (IF-3).
4. As proteínas transmembrana requiren orientación (péptidos de sinal), e o papel das chaperonas proteicas é (axuda a pregar a cadea peptídica na conformación nativa da proteína).
5. Os elementos dos promotores pódense dividir xeralmente en dous tipos: (elementos promotores básicos) e (elementos promotores upstream).
6. O contido da investigación da bioloxía molecular inclúe principalmente tres partes: (bioloxía molecular estrutural), (expresión e regulación xénica) e (tecnoloxía de recombinación do ADN).
7. Os dous experimentos fundamentais que demostran que o ADN é o material xenético son (infección por pneumococos de ratos) e (infección por fagos T2 de Escherichia coli).potencial).
8. Hai dúas diferenzas principais entre o ARNhn e o ARNm: (o ARNn empalmase no proceso de conversión en ARNm), (o extremo 5' do ARNm engádese cunha tapa m7pGppp, e hai unha poliadenilación extra no extremo 3' da cola do ácido do ARNm (poliA)).
9. As vantaxes da forma de proteínas multi-subunidade son (a subunidade é un método económico para a utilización do ADN), (pode reducir o impacto dos erros aleatorios na síntese de proteínas na actividade das proteínas), (a actividade pode ser moi eficiente e rapidamente ábrense e pechan).
10. O contido principal do mecanismo de pregamento de proteínas a teoría da primeira nucleación inclúe (nucleación), (enriquecemento estrutural), (reordenación final).
11. A galactosa ten un dobre efecto sobre as bacterias;por unha banda (pódese utilizar como fonte de carbono para o crecemento celular);por outra banda (tamén é un compoñente da parede celular).Polo tanto, é necesario un promotor S2 independente de AMPc-CRP para a síntese permanente a nivel de fondo;ao mesmo tempo, necesítase un promotor S1 dependente de AMPc-CRP para regular a síntese de alto nivel.A transcrición comeza por ( S2 ) con G e dende ( S1 ) sen G.
12. A tecnoloxía do ADN recombinante tamén se coñece como (clonación de xenes) ou (clonación molecular).O obxectivo final é (transferir a información xenética ADN dun organismo a outro organismo).Un experimento típico de recombinación de ADN adoita incluír os seguintes pasos: (1) Extraer o xene diana (ou xene exóxeno) do organismo doador e conéctalo enzimáticamente a outra molécula de ADN (vector de clonación) para formar unha nova molécula de ADN recombinante.② A molécula de ADN recombinante transfírese á célula receptora e replícase na célula receptora.Este proceso chámase transformación.③ Analizar e identificar aquelas células receptoras que absorberon o ADN recombinante.④Cultiva as células que conteñan ADN recombinante en grandes cantidades para detectar se se expresa o xene de axuda estranxeira.
13. Hai dous tipos de replicación de plásmidos: os que están estritamente controlados pola síntese de proteínas da célula hóspede chámanse (plásmidos axustados), e os que non están estritamente controlados pola síntese de proteínas da célula hóspede denomínanse (plásmidos relaxados).
14. O sistema de reacción PCR debería ter as seguintes condicións: a.Cebadores de ADN (unhas 20 bases) con secuencias complementarias en cada extremo das dúas cadeas do xene diana a separar.b.Enzimas con estabilidade térmica como: TagDNA polimerase.c, dNTPd, secuencia de ADN de interese como molde
15. O proceso de reacción básico da PCR inclúe tres etapas: (desnaturalización), (recocido) e (extensión).
16. O proceso básico dos animais transxénicos adoita incluír: ①Introdución de xenes estraños clonados no núcleo dun óvulo fecundado ou da célula nai embrionaria;②Transplante do óvulo fecundado inoculado ou da célula nai embrionaria no útero feminino;③Desenvolvemento e crecemento embrionario completos Para a descendencia con xenes estranxeiros;④ Use estes animais que poden producir proteínas estrañas como reprodutor para criar novas liñas homocigotas.
17. As liñas celulares de hibridoma xéranse hibridando células (bazo B) con células (mieloma), e dado que as (células do bazo) poden utilizar hipoxantina e (células óseas) proporcionar funcións de división celular, pódense cultivar en medio HAT.medrar.
18. Coa profundización da investigación, a primeira xeración de anticorpos chámase (anticorpos policlonais), a segunda xeración (anticorpos monoclonais) e a terceira xeración (anticorpos de enxeñería xenética).
19. Na actualidade, a enxeñaría xenética dos virus de insectos céntrase principalmente no baculovirus, que se manifesta na introdución de (xene da toxina esóxena);(xenes que perturban o ciclo de vida normal dos insectos);(modificación dos xenes do virus).
20. Os factores proteicos de acción trans correspondentes aos elementos comúns TATA, GC e CAAT no promotor da ARN polimerase II de mamíferos son (TFIID), (SP-1) e (CTF/NF1), respectivamente.
vinte un.Os factores de transcrición básicos da ARN polimerase Ⅱ son, TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, e a súa secuencia de unión é: (D, A, B, E).Onde a función de TFII-D é (enlace á caixa TATA).
Vinte dous.A maioría dos factores de transcrición que se unen ao ADN funcionan en forma de dímeros.Os dominios funcionais dos factores de transcrición que se unen ao ADN son normalmente os seguintes (hélice-xiro-hélice), (motivo de dedo de zinc), motivo de cremalleira (leucina básica).
vinte tres.Hai tres tipos de modos de escisión de endonuclease de restrición: (cortar no lado 5' do eixe de simetría para xerar extremos pegajosos de 5'), (cortar no lado 3' do eixe de simetría para xerar extremos pegajosos de 3' (cortar no eixe de simetría para xerar segmentos planos) ).
vintecatro.O ADN plasmídico ten tres configuracións diferentes: (configuración SC), (configuración oc), (configuración L).O primeiro en electroforese é (configuración SC).
25. Sistemas de expresión xenética exóxenos, principalmente (Escherichia coli), (Levedo), (Insectos) e (Táboa de células de mamíferos).
26. Os métodos de uso habitual para animais transxénicos son: (método de infección retroviral), (método de microinxección de ADN), (método de células nai embrionarias).
Aplicación Bioloxía Molecular
1. Nomea as funcións de máis de 5 ARN?
ARN de transferencia ARNt Aminoácido de transferencia Ribosoma ARN ARNr O ribosoma constitúe ARN mensaxeiro ARNm Modelo de síntese de proteínas ARN nuclear heteroxéneo ARNhn Precursor de ARNm maduro ARN nuclear pequeno ARNsn implicado no empalme de ARNn Pequeno ARN citoplasmático ARNc/7SL-proteína ARNc Componentes sintéticos e ARNn sintéticos localizados Sinal anti-localizado e sinal de ARNn expresión ARN ribozima ARN enzimaticamente activo
2. Cal é a principal diferenza entre os promotores procariotas e eucariotas?
TTGACA procariota --- TATAAT------Sitio de inicio-35 -10 Potenciador eucariota---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Sitio de inicio-110 -70 -25
3. Cales son os principais aspectos da construción artificial de plásmidos naturais?
Os plásmidos naturais adoitan presentar defectos, polo que non son axeitados para o seu uso como portadores para a enxeñaría xenética, e deben ser modificados e construídos: a.Engade xenes marcadores de selección axeitados, como dous ou máis, que son fáciles de usar para a selección, xeralmente xenes antibióticos.b.Aumentar ou diminuír os sitios de corte de encimas adecuados para facilitar a recombinación.c.Acurtar a lonxitude, cortar fragmentos innecesarios, mellorar a eficiencia de importación e aumentar a capacidade de carga.d.Cambia o replicón, de axustado a solto, de menos copias a máis copias.e.Engade elementos xenéticos especiais segundo os requisitos especiais da enxeñaría xenética
4. Pon un exemplo dun método para o cribado diferencial de ADNc específico do tecido?
Prepáranse dúas poboacións celulares, o xene diana exprésase ou exprésase altamente nunha das células, e o xene diana non se expresa ou se expresa pouco na outra célula, e despois atópase o xene diana mediante hibridación e comparación.Por exemplo, durante a aparición e desenvolvemento de tumores, as células tumorais presentarán ARNm con niveis de expresión diferentes aos das células normais.Polo tanto, os xenes relacionados co tumor poden ser eliminados mediante hibridación diferencial.O método de indución tamén se pode usar para detectar os xenes cuxa expresión é inducida.
5. Xeración e cribado de liñas celulares de hibridoma?
As células B de bazo + células de mieloma, engaden polietilenglicol (PEG) para promover a fusión celular, e as células de fusión de mieloma B esplénico cultivadas en medio HAT (que contén hipoxantina, aminopterina, T) seguen expandíndose nutríndose.A fusión celular contén: células de fusión bazo-bazo: incapaces de crecer, as células de bazo non se poden cultivar in vitro.Células de fusión óso-óso: non poden utilizar hipoxantina, pero poden sintetizar purina pola segunda vía usando folato redutase.A aminopterina inhibe a folato reductase e, polo tanto, non pode crecer.Células de fusión ósea e bazo: poden crecer en HAT, as células do bazo poden utilizar hipoxantina e as células óseas proporcionan a función de división celular.
6. Cal é o principio e o método para determinar a estrutura primaria do ADN polo método de terminación didesoxi terminal (método Sanger)?
O principio é utilizar un terminador de cadea de nucleótidos—2,,3,-didesoxinucleótidos para terminar a extensión do ADN.Dado que carece do 3-OH necesario para a formación de enlaces 3/5/fosfodiéster, unha vez incorporado á cadea de ADN, a cadea de ADN non se pode estender máis.Segundo o principio de emparellamento de bases, sempre que a ADN polimerase necesite dNMP para participar na cadea de ADN estendida normalmente, hai dúas posibilidades, unha é a de participar no ddNTP, o que resulta na terminación da extensión da cadea de desoxinucleótidos;a outra é participar no dNTP , para que a cadea de ADN aínda poida seguir estendéndose ata que se incorpore o seguinte ddNTP.Segundo este método, pódese obter un grupo de fragmentos de ADN de diferentes lonxitudes que rematan en ddNTP.O método consiste en dividir en catro grupos respectivamente ddAMP, ddGMP, ddCMP e ddTMP.Despois da reacción, a electroforese en xel de poliacrilamida pode ler a secuencia de ADN segundo as bandas de natación.
7. Cal é o efecto de regulación positiva da proteína activadora (CAP) na transcrición?
Proteína receptora de adenilato cíclico (AMPc) CRP (proteína receptora de AMPc), o complexo formado pola combinación de AMPc e CRP chámase CAP (proteína activada por cAMP).Cando se cultiva E. coli nun medio carente de glicosa, a síntese de CAP aumenta, e a CAP ten a función de activar promotores como a lactosa (Lac).Algúns promotores dependentes de CRP carecen da característica típica de secuencia da rexión -35 (TTGACA) que teñen os promotores comúns.Polo tanto, é difícil que a ARN polimerase se una a ela.A presenza de CAP (función): pode mellorar significativamente a constante de unión do encima e do promotor.Mostra principalmente os dous aspectos seguintes: ① CAP axuda á molécula do encima a orientarse correctamente cambiando a conformación do promotor e a interacción co encima, para combinarse coa rexión -10 e desempeñar o papel de substituír a función da rexión -35.②CAP tamén pode inhibir a unión da ARN polimerase a outros sitios do ADN, aumentando así a probabilidade de unirse ao seu promotor específico.
8. Que pasos adoitan incluírse nun experimento típico de recombinación de ADN?
a.Extrae o xene diana (ou xene esóxeno) do organismo doador e conéctao enzimáticamente a outra molécula de ADN (vector de clonación) para formar unha nova molécula de ADN recombinante.b.Transfire a molécula de ADN recombinante á célula receptora e replícase e consérvaa na célula receptora.Este proceso chámase transformación.c.Analizar e identificar aquelas células receptoras que absorberon o ADN recombinante.d.Cultiva en masa as células que conteñen o ADN recombinante para detectar se se expresa o xene de axuda estranxeira.
9. Construción da biblioteca de xenes Ofrécense tres métodos para a selección de recombinantes e descríbese brevemente o proceso.
Cribado de resistencia a antibióticos, inactivación insercional da resistencia, cribado de manchas brancas azuis ou cribado por PCR, cribado diferencial, sonda de ADN A maioría dos vectores de clonación levan xenes de resistencia a antibióticos (antiampicilina, tetraciclina).Cando o plásmido se transfire a Escherichia coli, as bacterias adquirirán resistencia, e aquelas sen transferencia non terán resistencia.Pero non pode distinguir se foi reorganizado ou non.Nun vector que contén dous xenes de resistencia, se se insire un fragmento de ADN estraño nun dos xenes e provoca a inactivación do xene, pódense usar dous controis de placas que conteñan diferentes fármacos para detectar recombinantes positivos.Por exemplo, o plásmido pUC contén o xene LacZ (que codifica a β-galactosidase), que pode descompoñer o substrato cromoxénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactosido) para producir azul, convertendo así a cepa en azul.Cando se insire o ADN estraño, o xene LacZ non se pode expresar, e a cepa é branca, para filtrar as bacterias recombinantes.
10. Explica o proceso básico de obtención de animais transxénicos mediante células nai embrionarias?
As células nai embrionarias (CE) son células embrionarias durante o desenvolvemento embrionario, que poden ser cultivadas e proliferadas artificialmente e teñen a función de diferenciarse noutro tipo de células.Cultivo de células ES: a masa celular interna do blastocisto está illada e cultivada.Cando o ES se cultiva nunha capa sen alimentador, diferenciarase en varias células funcionais, como células musculares e células N.Cando se cultiva nun medio que contén fibroblastos, o ES manterá a función de diferenciación.O ES pódese manipular xeneticamente, e a súa función de diferenciación pódese integrar sen afectar á súa función de diferenciación, o que resolve o problema da integración aleatoria.Introducir xenes esóxenos nas células nai embrionarias, despois implantar no útero de ratos femias preñadas, converterse en crías e cruzar para obter ratos homocigotos.
