Kit de qPCR Cell Direct RT—SYBR GREEN I Kits de qRT-PCR de un paso para lisis celular directa preparados para células
Descricións
Este kit usa un sistema de tampón de lise único que pode liberar rapidamente o ARN das mostras de células cultivadas para as reaccións RT-qPCR, eliminando así o laborioso e lento proceso de purificación de ARN.O modelo de ARN pódese obter en só 7 minutos.O 5×Direct RT Mix e 2×Os reactivos directos qPCR Mix-SYBR proporcionados polo kit poden obter resultados de PCR cuantitativos en tempo real de forma rápida e eficaz.
5×Direct RT Mix e 2×O mix-SYBR de qPCR directo ten unha forte tolerancia aos inhibidores e o lisado das mostras pódese usar como modelo para a RT-qPCR directamente.Este kit contén a única transcriptase inversa de ARN de alta afinidade Foregene e ADN polimerase Hot D-Taq, dNTPs, MgCl2, tampón de reacción, optimizador e estabilizador de PCR.
Especificacións
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Compoñentes do kit
| Parte I | Tampón CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Tampón ST | |
| Parte II | Borrador de ADN |
| 5 × Direct RT Mix | |
| 2 × Direct qPCR Mix-SYBR | |
| 50 × tintura de referencia ROX | |
| DdH2O libre de RNase | |
| Instrucións | |
Características e vantaxes
■Simple e eficaz: coa tecnoloxía Cell Direct RT, pódense obter mostras de ARN en só 7 minutos.
■ A demanda de mostra é pequena, só se poden probar 10 celas.
■ Alto rendemento: pode detectar rapidamente ARN en células cultivadas en placas de 384, 96, 24, 12 e 6 pocillos.
■ O borrador de ADN pode eliminar rapidamente os xenomas liberados, reducindo moito o impacto nos resultados experimentais posteriores.
■ O sistema optimizado de RT e qPCR fai que a transcrición inversa RT-PCR en dous pasos sexa máis eficiente e a PCR máis específica e máis resistente aos inhibidores da reacción RT-qPCR.
Aplicación do kit
Ámbito de aplicación: células cultivadas.
- ARN liberado pola lise da mostra: só aplicable ao modelo de RT-qPCR deste kit.
- O kit pódese utilizar para os seguintes fins: análise da expresión xénica, verificación do efecto silenciador de xenes mediado por ARNsi, cribado de fármacos, etc.
Diagrama
Almacenamento e vida útil
A parte I deste kit debe almacenarse a 4 ℃;A parte II debe almacenarse a -20 ℃.
Foregene Protease Plus II debe almacenarse a 4℃, non conxelar a -20 ℃.
Reactivo 2×Direct qPCR Mix-SYBR debe almacenarse a -20℃na escuridade;se se usa con frecuencia, tamén se pode almacenar en 4℃ para almacenamento a curto prazo (usar dentro de 10 días).
Principios de deseño de imprimacións de PCR en tempo real
Imprimación directa e imprimación inversa
Para a PCR en tempo real, o deseño do cebador é moi importante.Os cebadores están relacionados coa especificidade e a eficiencia da amplificación por PCR e pódense deseñar con referencia aos seguintes principios:
Lonxitude de imprimación: 18-30 bp.
Contido de GC: 40-60%.
Valor Tm: o software de deseño de imprimación, como Primer 5, pode dar o valor Tm da imprimación.Os valores de Tm dos cebadores augas arriba e augas abaixo deberían ser o máis próximos posible.Tamén se pode utilizar a fórmula de cálculo de Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Cando se realiza a PCR, xeralmente se selecciona unha temperatura por debaixo do valor Tm do cebador de 5 °C como temperatura de recocido (o aumento correspondente na temperatura de recocido pode aumentar a especificidade da reacción de PCR).
Cebadores e produtos de PCR:
A lonxitude do produto de amplificación da PCR do cebador de deseño é preferiblemente 100-150 pb.
Os imprimadores de deseño na zona estrutural secundaria da plantilla deben evitarse na medida do posible.
Evitar a formación de 2 ou máis bases complementarias entre os extremos 3′ dos cebadores augas arriba e augas abaixo.
A base terminal de cebador 3′ non pode estar presente con 3 G ou C consecutivos adicionais.
Os cebadores en si non poden ter estruturas complementarias, se non, formarase unha estrutura de horquilla, que afectará á amplificación da PCR.
O ATCG debe distribuírse o máis uniformemente posible na secuencia do cebador e debe evitarse a base terminal 3′ como T.
Apéndice 1: paquete complementario de compoñentes do kit Cell Direct RT-qPCR
1.Solución de lise celular
|
| |||
| Compoñentes do kit (sistema de lise de 24 pozos/pozo) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| Parteeu | Tampón CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Tampón ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| ParteII | Borrador de ADN | 400 μl | 1 ml × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| Compoñentes do kit (sistema de reacción 20 μl) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5 × Direct RT Mix | 800 μl |
| DdH libre de RNase2O | 1,7 ml × 2 |
|
| ||
| Compoñentes do kit (sistema de reacción 20 μl) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2 × Direct qPCR Mix-SYBR | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
| 50 × tintura de referencia ROX | 40 μl | 200 μl |
| DdH libre de RNase2O | 1,7 ml | 10 ml |
Manuais de instrucións:
