Escherichia Coli O157: Kit de detección de ácidos nucleicos H7 (método de sonda fluorescente PCR/liofilización)
Descrición do kit:
Cat.No.FP103
Utilízase para a detección e detección rápida de E. coli O157:H7 en mostras de alimentos, pensos, auga e mostras ambientais.
Descricións
Úsase paradetección e detección rápida de E. coli O157:H7 en mostras de alimentos, pensos, auga e mostras ambientais.
[Principio de proba]
Segundo o principio da tecnoloxía de PCR fluorescente, os cebadores específicos e as sondas Taqman están deseñados para o xene específico de Escherichia coli O157: H7 e son detectados por un instrumento de PCR fluorescente, para realizar a detección de Escherichia coli O157: H7 Detección cualitativa de ADN.
Contido do kit
Nota: a sonda de canle ROX non está incluída.
| Copoñentes | Especificación | Qunidade |
| Tampón A | Tubo | 1 |
| Tampón B | Tubo | 1 |
| Control positivo | Tubo | 1 |
| Control negativo | Tubo | 1 |
Uso esperado
Úsase para detección e detección rápida de E. coli O157:H7 en mostras de alimentos, pensos, auga e mostras ambientais.
Condicións de almacenamento e data de caducidade
Almacene a -20 ℃ na escuridade e evite conxelacións e desconxelacións repetidas.
O prazo de validez é 12meses, e a data de produción aparece no envase exterior.
Instrumentos e consumibles
Instrumento de PCR cuantitativo fluorescente, pistola de pipeta e puntas coincidentes, agitador vórtice, mini centrífuga.
Uso
1. Procesamento da mostra
1.1 Tipo de mostra: este kit é adecuado para mostras de alimentos, pensos, auga e outras mostras sospeitosas de estar contaminadas por Escherichia coli O157:H7.En caso de produtos cárnicos, bebidas e outras substancias que conteñan pigmentos, é necesario enxágüelos para non afectar a recollida de sinais de fluorescencia.
1.2 Procesamento da mostra: consulte "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test" para a preparación da mostra, o cultivo de enriquecemento e o illamento de Escherichia coli O157: H7.
- Nextracción de ácido ucleico
Tome 20 mL de solución de enriquecemento nun tubo de centrífuga de 1,5 mL, engade 200 µL de lisado microbiano (requírese un kit adicional), agite durante 30 segundos, centrifugue brevemente e deixe de lado.
Observacións: a extracción do ácido nucleico do lisado debe completarse en 10 minutos e non se pode almacenar durante moito tempo.
3. Amplificación de ácidos nucleicos
3.1 Encender o instrumento de PCR cuantitativa fluorescente para o seu uso.
Tampón A e Tampón B do kit, fórdaos completamente e centrifugue brevemente.Engade 18 μl de tampón A e 2 μl de tampón B a cada tubo de reacción de PCR.A continuación, engade 5 ml de control negativo, ácido nucleico extraído e control positivo nos tubos de reacción de PCR, tape os tubos e centrifugue brevemente.
3.3 Transfire o tubo de reacción de PCR a unha máquina de PCR fluorescente e use os seguintes procedementos para realizar experimentos de amplificación: seleccione 25 ml para o sistema de reacción, recolle sinais de fluorescencia a 60 °C para cada ciclo e seleccione FAM para a canle de detección.
| Paso | Programa | Número de ciclos |
| 1 | 37 ℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15 s | 40 |
| 60℃ 30s (recoller fluorescencia) |
Guías para a análise de problemas
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Non se pode extraer ARN ou o rendemento de ácido nucleico é baixo
Normalmente hai moitos factores que afectan á eficiencia da recuperación, como: contido de ARN da mostra, método de operación, volume de elución, etc.
Análise de causas comúns:
1.Baño de xeo ou centrifugación a baixa temperatura (4 ° C) durante o funcionamento.
Suxestión: Funcionamento a temperatura ambiente (15-25 °C), nunca baño de xeo e centrífuga a baixa temperatura.
2. Almacenamento inadecuado da mostra ou almacenamento da mostra durante demasiado tempo.
Suxestión: almacenar as mostras a -80 ° C ou conxelar en nitróxeno líquido e evitar o uso repetido de conxelación e desconxelación;intente utilizar mostras recén recollidas para a extracción de ARN.
3.Lise da mostra insuficiente
Recomendación: asegúrese de que a mostra e a solución de traballo (acrilamida lineal) se mesturaron e incubaron 10 min a temperatura ambiente (15-25 °C)
4.O eluyente engadiuse incorrectamente
Recomendación: asegúrese de que se engade ddH2O sen RNase ao medio da membrana da columna de purificación
5.Volum inadecuado de etanol anhidro no tampón viRW2
Suxestión: siga as instrucións, engada o volume correcto de etanol anhidro ao Buffer viRW2 e mestúreos ben antes de usar o kit.
6.Uso incorrecto da mostra.
Suxestión: 200 µl de mostra por 500 µl de Buffer viRL.Un volume de mostra excesivo producirá unha redución da taxa de extracción de ARN.
7.Volume de elución incorrecto ou elución incompleta.
Suxestión: o volume de eluyente da columna de purificación é de 30-50μl;se o efecto de elución non é satisfactorio, recoméndase engadir RNase-Free ddH precalentado2O e prolongar o tempo poñendo a temperatura ambiente, como 5-10min
8.Columna de purificación ten residuos de etanol despois de enxágüe no tampón viRW2.
Suxestión: se aínda queda etanol despois de lavar no Buffer viRW2 e centrifugar en tubo baleiro durante 2 minutos, a columna de purificación pódese deixar a temperatura ambiente durante 5 minutos despois da centrifugación en tubo baleiro para eliminar completamente o etanol restante.
A degradación de moléculas de ARN purificadas
A calidade do ARN purificado está relacionada con factores como o almacenamento da mostra, a contaminación por RNase e o funcionamento.
Análise de causas comúns:
1.As mostras recollidas non se gardaron a tempo.
Suxestión: se a mostra non se usa a tempo despois da recollida, almacénaa a -80 ℃ ou nitróxeno líquido inmediatamente.Para a extracción de moléculas de ARN, intente utilizar mostras recén recollidas sempre que sexa posible.
2. As mostras recollidas conxeláronse e desconxeláronse repetidamente.
Suxestión: Evite a conxelación e desconxelación repetidas (non máis dunha vez) durante a recollida e almacenamento da mostra, se non, o rendemento de ácido nucleico diminuirá.
3.Introduciuse a RNase no quirófano ou non se usaron luvas, máscaras, etc.
Suxestión: o experimento de extracción de moléculas de ARN realízase mellor nunha sala de operacións de ARN separada e a mesa experimental límpase antes do experimento.Use luvas e máscaras desbotables durante o experimento para evitar a degradación do ARN causada pola introdución de RNase.
4.O reactivo está contaminado pola RNase durante o uso.
Suxestión: Substitúeo por un novo kit de illamento de ARN viral para experimentos relacionados.
5.A contaminación por RNase dos tubos de centrífuga, puntas de pipetas, etc. Suxestión: asegúrese de que os tubos de centrífuga, as puntas das pipetas e as pipetas estean libres de RNase.
As moléculas de ARN purificadas afectaron aos experimentos posteriores
As moléculas de ARN purificadas pola columna de purificación afectarán aos experimentos posteriores se hai demasiados ións de sal ou proteínas, como: transcrición inversa, Northern Blot, etc.
1.Quedan ións de sal restantes nas moléculas de ARN eluídas.
Recomendación: asegúrese de que se engade o volume correcto de etanol anhidro ao Buffer viRW2 e lave a columna de purificación dúas veces segundo a velocidade de centrifugación correcta das instrucións de operación; Se aínda quedan ións de sal, pode engadir o Buffer viRW2 á columna de purificación e deixalo a temperatura ambiente durante 5 minutos.A continuación, realice a centrifugación para eliminar a contaminación dos ións de sal na maior medida
2.Hai etanol restante nas moléculas de ARN eluídas
Suxestión: unha vez confirmado que as columnas de purificación foron aclaradas mediante Buffer viRW2, realice a centrifugación en tubo baleiro segundo a velocidade centrífuga das instrucións de funcionamento.Se aínda queda etanol, pódese deixar durante 5 minutos a temperatura ambiente despois dunha centrifugación en tubo baleiro para eliminar o etanol restante na maior medida.
Manuais de instrucións:
Manual de instrucións do kit de illamento de ARN viral
