Temos un fabricante experimentado.Gañando a maioría nas certificacións cruciais do seu mercado para grandes descontos China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, a calidade é a vida da fábrica, o foco na demanda dos clientes é a fonte de supervivencia e desenvolvemento da empresa, adherimos á honestidade e á boa fe actitude de traballo, esperando a túa chegada.
Temos un fabricante experimentado.Gañando a maioría nas certificacións cruciais do seu mercado paraADN polimerase China Taq, Qpcr, A nosa empresa promete: prezos razoables, curto tempo de produción e servizo posvenda satisfactorio, tamén lle damos a benvida a visitar a nosa fábrica en calquera momento.Oxalá agora teñamos un negocio agradable e a longo prazo xuntos!!!

Descricións

Este kit usa un sistema de tampón de lise único que pode liberar rapidamente o ARN das mostras de células cultivadas para as reaccións RT-qPCR, eliminando así o laborioso e lento proceso de purificación de ARN.O modelo de ARN pódese obter en só 7 minutos.Os reactivos 5×Direct RT Mix e 2×Direct qPCR Mix-SYBR proporcionados polo kit poden obter resultados de PCR cuantitativos en tempo real de forma rápida e eficaz.

5×Direct RT Mix e 2×Direct qPCR Mix-SYBR teñen unha forte tolerancia aos inhibidores, e o lisado das mostras pódese usar como modelo para a RT-qPCR directamente.Este kit contén a única transcriptase inversa de ARN de alta afinidade Foregene e ADN polimerase Hot D-Taq, dNTPs, MgCl₂, tampón de reacción, optimizador e estabilizador de PCR.

Especificacións

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Compoñentes do kit

Características e vantaxes

■ Simple e eficaz: coa tecnoloxía Cell Direct RT, pódense obter mostras de ARN en só 7 minutos.

■ A demanda de mostra é pequena, só se poden probar 10 celas.

■ Alto rendemento: pode detectar rapidamente ARN en células cultivadas en placas de 384, 96, 24, 12 e 6 pocillos.

■ O borrador de ADN pode eliminar rapidamente os xenomas liberados, reducindo moito o impacto nos resultados experimentais posteriores.

■ O sistema optimizado de RT e qPCR fai que a transcrición inversa RT-PCR en dous pasos sexa máis eficiente e a PCR máis específica e máis resistente aos inhibidores da reacción RT-qPCR.

Aplicación do kit

Ámbito de aplicación: células cultivadas.

- ARN liberado pola lise da mostra: só aplicable ao modelo de RT-qPCR deste kit.

- O kit pódese utilizar para os seguintes fins: análise da expresión xénica, verificación do efecto silenciador de xenes mediado por ARNsi, cribado de fármacos, etc.

Diagrama

Almacenamento e vida útil

A parte I deste kit debe almacenarse a 4 ℃;A parte II debe almacenarse a -20 ℃.

Foregene Protease Plus II debe almacenarse a 4 ℃, non conxelar a -20 ℃.

O reactivo 2×Direct qPCR Mix-SYBR debe almacenarse a -20 ℃ na escuridade;se se usa con frecuencia, tamén se pode almacenar a 4 ℃ para almacenamento a curto prazo (usar dentro de 10 días). Temos un fabricante experimentado.Gañando a maioría das certificacións cruciais do seu mercado para o gran desconto de China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, a calidade é a vida da fábrica, o foco na demanda dos clientes é a fonte de supervivencia e desenvolvemento da empresa, adherimos á honestidade e á boa fe actitude de traballo, esperando a túa chegada.
Gran descontoADN polimerase China Taq, Qpcr, A nosa empresa promete: prezos razoables, curto tempo de produción e un servizo posvenda satisfactorio, tamén che invitamos a visitar a nosa fábrica en calquera momento que queiras.Oxalá agora teñamos un negocio agradable e a longo prazo xuntos!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Para RT-qPCR directa celular usando ≤ 1000.000 células

Presentación do produto

Este produto usa un sistema de tampón de lise único para liberar rapidamente o ARN das mostras de células cultivadas para as reaccións RT-qPCR, eliminando o laborioso e laborioso proceso de purificación de ARN, e só 7 minutos para obter o modelo de ARN necesario, co Direct RT Mix 5×, Direct qPCR Mix-Taqman 2× proporcionado polo kit pode obter resultados de PCR en tempo real e cuantitativo de forma rápida e eficiente.

5× Direct RT Mix e 2× Direct qPCR Mix-Taqman teñen unha forte tolerancia aos inhibidores e poden realizar unha reversión eficiente e unha amplificación específica utilizando o lisado da mostra que se vai medir como modelo.O reactivo contén Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, que se pode usar co tampón de lise para detectar de xeito rápido e sinxelo mostras, e ten as características de alta sensibilidade, especificidade e estabilidade.

Características do produto

Tecnoloxía Cell Direct RT sinxela e eficaz que leva tan só 7 minutos en obter mostras de ARN.

Os requisitos de mostra son pequenos e pódense utilizar un mínimo de 10 células cultivadas para a experimentación.

Alto rendemento para a adquisición rápida de ARN de células cultivadas como placas de 384, 96, 24, 12 e 6 pocillos.

DNA Eraser é capaz de eliminar rapidamente os xenomas liberados, reducindo moito o impacto nos resultados experimentais posteriores.

Os sistemas optimizados de RT e qPCR permiten a RT-PCR en dous pasos cunha transcrición inversa máis eficiente, especificidade e unha tolerancia máis forte ao inhibidor da reacción RT-qPCR.

Aplicación do kit

Ámbito de aplicación: Células cultivadas.

ARN interpretado por lise da mostra: usado só como modelo de RT-qPCR en dous pasos.

Os kits pódense utilizar para os seguintes propósitos: análise da expresión reguladora dos xenes, probas de alelos, detección de fármacos, etc.

Limitacións do kit

Fragmentos amplificados ≤ 300 pb.

Os kits úsanse para cultivar células recentemente.

Control de calidade do produto

Segundo o Sistema de Xestión da Calidade Total de FOREGENE, cada lote de kits da serie Cell Direct RT-qPCR é probado rigorosamente varias veces para garantir a fiabilidade e estabilidade da calidade de cada lote de kits.

Contido do kit

*:Lisis celular, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman pódense mercar por separado; os detalles ofrécense no Apéndice 1 (PÁXINA 13).

Condicións de almacenamento

1. Condicións de envío

Todo o proceso de transporte da caixa de xeo a baixa temperatura, para garantir que o kit estea nun estado <4 °C.

2. Condicións de almacenamento

Almacene a parte I a 4 °C e a parte II a -20 °C.

O Foregene Protease Plus II debe almacenarse a 4 °C, non conxelar a -20 °C.

O reactivo 2× Direct qPCR Mix-Taqman almacénase a -20 °C, ou a 4 °C para uso a curto prazo se se usa con frecuencia (dentro de 10 días).

Información dos compoñentes do kit

Buffer CL: proporciona o ambiente necesario para as reaccións de lise celular.

Tampón ST: Termina a substancia activa no lisado para evitar efectos sobre a RT posterior.

Borrador de ADN: eliminador de ADN, o efecto de eliminar o xenoma en experimentos posteriores.

5 × Direct RT Mix: contén transcriptase inversa de xene anterior de alta afinidade, inhibidor de RNase, dNTPs, estabilizadores, potenciadores, optimizadores e cebadores de transcrición inversa para un aliñamento óptimo (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: no contexto do tampón de lise, as células son lisadas para liberar ácidos nucleicos.

2× qPCR directo Mix-Taqman: este reactivo contén ADN polimerase D-Taq quente, dNTPs, MgCl₂, tampón de reacción, optimizador de PCR e estabilizador.

Colorante de referencia 20 × ROX: xeralmente usado nos instrumentos de amplificación de PCR en tempo real de ABI, Stratagene e outras empresas, úsase para axustar a diferenza entre tubos e tubos de PCR causados ​​por erros de dosificación da PCR.A concentración de 20 × ROX Reference Dye necesaria para os diferentes instrumentos é diferente e o usuario pode engadila segundo a concentración recomendada do instrumento.

DdH libre de RNase₂O: auga ultra pura esterilizada sen RNase para reaccións RT-qPCR en dous pasos.

Precaucións:(Asegúrate de ler atentamente as precaucións antes de usar o kit)

Preste atención ao método de operación do experimento para evitar a contaminación cruzada entre as mostras.

Preste atención á limpeza do ambiente experimental e dos utensilios para evitar a contaminación da RNase e a degradación do ARN.

Tome mostras de células frescas ou ben conservadas e nunca use mostras de células conxeladas e desconxeladas repetidas.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman debería evitar a conxelación e desconxelación repetidas, se non, afectará a transcrición inversa e a eficiencia da PCR.

Preparaciónsantesoperación

Asegúrese de ler atentamente as instrucións antes de usar este kit.O kit Cell Direct RT-qPCR é sinxelo, cómodo e rápido de operar, e as instrucións proporcionan información completa sobre todo o kit e como usalo correctamente.Prepare os materiais e equipos experimentais necesarios antes do uso.

Materiais e equipamentos experimentais

◆ Cultivo de células.

◆ 1,5 ml ou 2 ml, tubo de centrífuga sen RNase/DNase, punta sen RNase/DNase, tubo qPCR estéril de 0,2 ml.

◆ máquina qPCR, pipeta, centrífuga de mesa (≥13.400×g) (dependendo das necesidades experimentais), etc.

Seguridade

◆ Este produto é só para fins de investigación científica, non o use con fins farmacéuticos, clínicos, alimentarios e cosméticos.

◆ Cando use produtos químicos, use roupa de laboratorio, luvas, lentes de protección, etc.

Operaciónguías

Os sistemas de lise celular, os sistemas RT e os paquetes de suplementos de solución de reacción qPCR pódense adquirir por separado, para obter máis información no Apéndice 1 (PÁXINA 13).

Guía de operación

R: Liberación de ARN da mostra

1. Pretratáronse as células: lave a placa de cultivo celular con PBS frío, despois lise as células (10-10⁶), 10⁶ que a cantidade de células, recoméndase Foregene the Cell an ARN Isolation Kit the Total (DE-03111) ou Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) para a extracción e purificación de ARN.

1.1.Células adherentes (placa de 24 pozos como exemplo)

1.1.1.Determine o número de celas en cada pozo, determine que o número de celas é 1 × 10⁵, e use unha pipeta para eliminar o medio de cultivo da placa de cultivo.

1.1.2.Engade 200 μl de 1 × PBS pre-refrigerado a cada pozo.Non pipetee repetidamente e elimine o PBS dos pozos.Incline a placa e elimine a maior cantidade de PBS posible.Continúa co paso 2.

1.1.3.Engadíronse un prato de cultivo celular diferente ou unha táboa de números de referencia 1-1 nun prato de cultivo celular pre-refrixerado 1 × PBS para o lavado celular.

Táboa 1-1: dosificación de PBS para diferentes números de células

Nota:Para garantir unha firme adherencia das células,un gran número de perdas celulares evitadas ao lavar.

1.2.Células en suspensión ou células adherentes cultivadas en placas non porosas

1.2.1.As células adherentes cultivadas en placas non multipozo (as células en suspensión comezan a partir do seguinte paso 1.2.2), recollen e separan as células segundo o método normal de recollida de células e colócaas nunha placa de cultivo ou tubo de centrífuga;se se utiliza a tripsinización, require centrifugación para recoller as células e eliminar a tripsina residual, engadíronse células resuspendidas con PBS en células individuais para dispersar as células.

1.2.2.Despois do número de células contadas, alícuotas células 1×10⁵ un para centrifugar tubos, recoller as células por centrifugación a 1000 × g durante 10 min.

1.2.3.Engade 200 μl de PBS ao tubo da centrífuga, non pipetee repetidamente e aspire directamente o PBS.pasar ao paso 2. (Se é difícil precipitar e as células foron resuspendidas de novo, pódese realizar unha centrifugación de 1000 × g 10 min despois de descartar o sobrenadante, o sedimento celular vaia ao paso 2)

2.Lise celular: elimine o tampón CL, a súa temperatura equilibrada á temperatura ambiente, o borrador de ADN e o Foregene Protease Plus II, segundo a seguinte táboa 1-2 sistema de lise preparado: (a solución de lise está lista para o seu uso).

Táboa 1-2: escisión preparación do sistema (Nota: na preparación sobre xeo)

3.(Placa de 24 pozos como exemplo) Pipetear 200 μl de mestura mestra de lise celular en cada pozo, soprar repetidamente 5-10 veces, incubar a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 min.

Nota:Para evitar a formación de burbullas, cando pipetee a escala de pipeta axustouse a 200 μl ou menos.As células poden aparecer turbias despois da lise, o que é normal.

4.(Placa de 24 pozos como exemplo) engádese ao líquido 20 μl de Tampón ST (distintos sistemas de lise Tampón ST engadido nunha cantidade mostrada na Táboa 1-3), pipeteando repetidamente 5-10 veces, a temperatura ambiente (20-25 ℃) foron incubados durante 2 min.

Nota:A punta da pipeta dispúxose debaixo da superficie, garantindo que se engade o lisado,para evitar a formación de burbullas, por favor, cando pipetear a escala de pipeta foi axustada a 200μl ou menos.

Táboa 1-3:Engadir buffer ST

5.O lisado úsase para posteriores experimentos de RT-qPCR.Se os experimentos posteriores non se poden realizar a tempo, manténao no xeo durante non máis de 2 horas e gárdao a -20 ℃ ou -80 ℃ (non máis de tres meses).

B: Preparación do sistema RT

1.Saca 5 × Direct RT Mix e colócao nun baño de xeo, deixa que se derrita de forma natural e mestúrao suavemente para o seu uso posterior;Saque RNase-Free ddH2O e derréteo e colócao nun baño de xeo para o seu uso posterior.Prepare o sistema de reacción sobre xeo segundo a táboa 2-1 a continuación.

Táboa 2-1: Preparación do sistema de reacción RT

2. Despois de completar a formulación do sistema, mestura suavemente e centrifuga brevemente na seguinte táboa 2 -2 condicións de reacción reacción RT.

Táboa 2-2: Configuración da condición de reacción RT

3. Despois de completar a reacción, o produto de reacción colocouse directamente sobre xeo para qPCR, coloque a conservación a longo prazo -20 ℃ ou -80 ℃.

Nota: debido ao uso de plantillas non purificadas, poden aparecer precipitados brancos no produto de transcrición inversa.Este é un fenómeno normal.Centrifugue o sobrenadante inmediatamente para experimentos posteriores.

A solución de reacción RT resultante engádese aos seguintes sistemas de reacción de PCR en tempo real de paso, recoméndase engadir cantidades que van do 10 ao 30% do sistema de reacción.

C: Preparación do sistema de reacción qPCR

1. Cantidade axeitada de B preparada no modelo de ADNc do paso segundo a seguinte táboa 3-1 para preparar un sistema de reacción.

Nota: a cantidade de modelo de ADNc representa o 10-30% do sistema qPCR.Por exemplo, nun sistema qPCR de 20 μl, engade 2-6 μl de tampón de lise, pero non máis de 6 μl.

2.A optimización das boas condicións de qPCR (temperatura de recocido, etc.) para a reacción de qPCR (as condicións de reacción indicadas na táboa 3-2).

Nota: intente utilizar condicións optimizadas para as reaccións de qPCR para obter mellores resultados.

Táboa 3-1: Preparación do sistema de reacción PCR

1*: A concentración do cebador pódese axustar no intervalo de 50-900 nM cando o rendemento da reacción do cebador é pobre.

Nota: O sistema qPCR pódese axustar segundo as necesidades experimentais e o modelo de ciclador de fluorescencia.Para qPCR nun 50μl sistema, axuste a dosificación do reactivo proporcionalmente segundo o 20μl sistema.

2*: Seleccione a concentración final adecuada de ROX Reference Dye segundo o termociclador cuantitativo de fluorescencia.As concentracións de colorante de referencia ROX máis adecuadas para os cicladores cuantitativos de fluorescencia comúns móstranse na seguinte táboa:

Táboa 3-2: ofrécense as condicións da reacción qPCR

Nota: Para obter o mellor efecto de qPCR, pódese usar a PCR en gradiente para optimizar as condicións de reacción para diferentes modelos e diferentes cebadores.As condicións de reacción da PCR varían segundo o analizador de fluorescencia, o modelo, o cebador, etc. Na operación específica, as condicións de reacción óptimas deben deseñarse segundo as condicións específicas do termociclador cuantitativo de fluorescencia, o tipo de molde, o tamaño do fragmento de interese, a secuencia de bases do fragmento amplificado e o contido e a duración do cebador en GC, incluíndo a temperatura de recocido, o tempo de reacción, etc.

Principios de deseño de imprimacións de PCR en tempo real

Imprimación directa e imprimación inversa

Para a PCR en tempo real, o deseño do cebador é moi importante.Os cebadores están relacionados coa especificidade e a eficiencia da amplificación por PCR e pódense deseñar con referencia aos seguintes principios:

◆ Lonxitude de imprimación: 18-30 pb.

◆ Contido de GC: 40-60%.

◆ Valor Tm: o software de deseño de imprimación, como Primer 5, pode dar o valor de Tm da imprimación.Os valores de Tm dos cebadores augas arriba e augas abaixo deberían ser o máis próximos posible.Tamén se pode utilizar a fórmula de cálculo de Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Cando se realiza a PCR, xeralmente se selecciona unha temperatura por debaixo do valor Tm do cebador de 5 °C como temperatura de recocido (o aumento correspondente na temperatura de recocido pode aumentar a especificidade da reacción de PCR).

◆ Cebadores e produtos de PCR:

◆ A lonxitude do produto de amplificación da PCR do cebador de deseño é preferiblemente 100-150 pb.

◆ Os imprimadores de deseño na zona estrutural secundaria da plantilla deben evitarse na medida do posible.

◆ Evitar a formación de 2 ou máis bases complementarias entre os extremos 3′ dos cebadores augas arriba e augas abaixo.

◆ A base terminal de cebador 3′ non pode estar presente con 3 G ou C consecutivos adicionais.

◆ Os cebadores en si non poden ter estruturas complementarias, se non, formarase unha estrutura de horquilla que afectará á amplificación da PCR.

◆ O ATCG debe distribuírse o máis uniformemente posible na secuencia do cebador e debe evitarse a base terminal 3′ como T.

Apéndice1:Cell DirectoRT-qPCR Compoñente do kitpaquete de suplementos t

1. Solución de lise celular