Esterilización de puntas de pipeta e tubos EP, etc.
1. Prepara un 0,1% (un milésima parte) de DEPC (substancia altamente tóxica) con auga desionizada, utilízaa con coidado nunha campana de extracción e gárdaa a 4 °C lonxe da luz;
A auga DEPC é auga pura tratada con DEPC e esterilizada por alta temperatura e alta presión.Probouse para estar libre de RNase, DNase e proteinase.
2. Coloque a punta da pipeta e o tubo EP nun DEPC ao 0,1% e asegúrese de que a punta da pipeta e o tubo EP estean cheos con DEP ao 0,1%.
3. Protexer da luz, deixar repousar durante a noite (12-24h)
4. A caixa que contén a punta e o tubo EP non necesita ser empapada en DEPC.Despois de eliminar aproximadamente a auga DEPC da punta ou do tubo EP, empaquetaa e envólvela.
5. 121 graos centígrados, 30min
6. 180 graos Celsius, seco durante varias horas (polo menos 3 horas)
Nota: a.Use luvas e máscaras de látex cando manipule DEPC!b, ou sen esterilización DEPC, 130 ℃, autoclave de 90 min (moitos laboratorios de esterilización a alta temperatura dúas veces)
Consideracións sobre a extracción de ARN
Dous fenómenos principais de falla de illamento do ARN do tecido
degradación do ARN e residuos de impurezas nos tecidos,en canto á degradación, vexamos primeiro por que o ARN extraído das células cultivadas non se degrada facilmente.Os reactivos de extracción de ARN existentes conteñen todos os compoñentes que inhiben rapidamente a RNase.Engade o lisado ás células cultivadas e simplemente mestúrao, todas as células pódense mesturar completamente co lisado e as células están completamente lisadas.Despois de que as células sexan lisadas, os ingredientes activos do lisado inhiben inmediatamente a RNase intracelular, polo que o ARN permanece intacto.É dicir, debido a que as células cultivadas entran en contacto facilmente e totalmente co lisado, o seu ARN non se degrada facilmente;por outra banda, o ARN do tecido degrádase facilmente porque as células do tecido non son fáciles de contactar rapidamente co lisado.debido a un contacto suficiente.Entón,supoñendo que hai unha forma de converter o tecido nunha soa célula mentres se inhibe a actividade do ARN, o problema da degradación podería resolverse completamente.
A moenda de nitróxeno líquido é o método máis eficaz deste tipo.Non obstante, o método de moenda de nitróxeno líquido é moi problemático, especialmente cando o número de mostras é grande.Isto deu lugar ao seguinte mellor: o homoxeneizador.OhomoxeneizadorO método non considera a cuestión de como se inhibe a actividade da RNase antes de que as células entren en contacto co lisado, senón que preza que a taxa de ruptura do tecido sexa máis rápida que a velocidade á que a RNase intracelular degrada a RN.
O efecto do homoxeneizador eléctrico é mellor,e o efecto do homoxeneizador de vidro é pobre, pero en xeral, o método do homoxeneizador non pode evitar o fenómeno de degradación.Polo tanto, se a extracción é degradada, o homoxeneizador eléctrico orixinal debe usarse para moer con nitróxeno líquido;o homoxeneizador de vidro orixinal debe cambiarse por un homoxeneizador eléctrico ou moer directamente con nitróxeno líquido.O problema é case 100% factible.resolver.
O problema dos residuos de impurezas que afecta a experimentos posteriores ten causas máis diversas que a degradación, e as solucións son en consecuencia diferentes.En conclusión,se hai degradación ou impurezas residuais no tecido, débese optimizar o método/reactivo de extracción para o material experimental específico.Non tes que utilizar as túas preciosas mostras para a optimización: podes mercar no mercado algúns animais pequenos como peixe/polo, levar a parte correspondente do material para a extracción de ARN e a outra parte para a extracción de proteínas: moer coa boca, estómago e intestinos Extracto.
O ARN obxectivo do ARN extraído úsase para diferentes experimentos de seguimento e os seus requisitos de calidade son diferentes
A construción da biblioteca de ADNc require integridade do ARN sen residuos de inhibidores da reacción enzimática;Northern require unha maior integridade do ARN e menores requisitos para os residuos de inhibidores da reacción enzimática;A RT-PCR non require unha integridade de ARN demasiado alta,pero inhibe as reaccións enzimáticas.Os requisitos de residuos son estritos.A entrada determina a saída;cada vez que o obxectivo é obter o ARN de maior pureza, custará á xente e diñeiro.
Recollida/Almacenamento de mostras
Factores que afectan á degradación Despois de que a mostra abandona o corpo vivo/ou o ambiente de crecemento orixinal, os encimas endóxenos da mostra comezarán a degradar o ARN,e a taxa de degradación está relacionada co contido de encimas endóxenos e coa temperatura.Tradicionalmente, só hai dúas formas de inhibir completamente a actividade enzimática endóxena: engadir lisado inmediatamente e homoxeneizar de forma completa e rápida;cortar en anacos pequenos e conxelar inmediatamente en nitróxeno líquido.Ambos enfoques requiren unha operación rápida.Este último é apto para todas as mostras, mentres que o primeiro só é apto para tecidos con baixo contido de células e encimas endóxenos e máis fáciles de homoxeneizar.En concreto, o tecido vexetal, o fígado, o timo, o páncreas, o bazo, o cerebro, a graxa, o tecido muscular, etc., conxélanse mellor con nitróxeno líquido antes de continuar.
Fragmentación e homoxeneización de mostras
Factores que afectan á degradación e ao rendemento A fragmentación da mostra épara unha homoxeneización completa, que é para a liberación completa e completa de ARN.As células pódense homoxeneizar directamente sen romperse.Os tecidos poden homoxeneizarse só despois de romperse.Os lévedos e as bacterias deben romperse cos encimas correspondentes antes de que poidan homoxeneizarse.Os tecidos con menor contido en enzima endóxeno e unha homoxeneización máis sinxela poden ser triturados e homoxeneizados ao mesmo tempo no lisado por un homoxeneizador;tecido vexetal, fígado, timo, páncreas, bazo, cerebro, graxa, tecido muscular e outras mostras, ou son ricos en encimas endóxenos ou non se homoxeneizan facilmente,polo que a ruptura dos tecidos e a homoxeneización deben realizarse por separado.O método de fragmentación máis fiable e produtivo é a moenda con nitróxeno líquido, e o método máis fiable de homoxeneización é o uso dun homoxeneizador eléctrico.Unha nota especial sobre a moenda con nitróxeno líquido: a mostra non debe desconxelarse durante todo o proceso de moenda, xa que os encimas endóxenos teñen máis probabilidades de funcionar cando se conxelan.
Selección de lisado
Afectando á comodidade de operación e aos factores de impurezas endóxenas residuais As solucións de lise de uso habitual case poden inhibir a actividade da RNase.Polo tanto, o punto clave para escoller unha solución de lise é considerar en combinación co método de purificación.Hai unha excepción:Recoméndase que as mostras con alto contido de encimas endóxenos utilicen un lisado que conteña fenol para aumentar a capacidade de inactivar encimas endóxenas.
Elección do método de purificación
Factores que afectan ás impurezas endóxenas residuais, velocidade de extracción Para mostras limpas, como células, pódense obter resultados satisfactorios con case calquera método de purificación que teña a man.Pero para moitas outras mostras, especialmente aquelas con altos niveis de impurezas como plantas, fígado, bacterias, etc., a elección dun método de purificación axeitado é fundamental.O método de purificación centrífuga en columna ten unha velocidade de extracción rápida e pode eliminar eficazmente as impurezas que afectan á posterior reacción enzimática do ARN, pero é caro (Foregene pode ofrecer kits económicos, máis detalles fai clic enaquí);utilizando métodos de purificación económicos e clásicos, como a precipitación de LiCl, tamén se poden obter resultados satisfactorios, pero o tempo de operación é longo..
"Tres disciplinas e oito atencións" para a extracción de ARN
Disciplina 1:Poñer fin á contaminación de encimas esóxenos.
Nota 1:Use estrictamente máscaras e luvas.
Nota 2:Os tubos de centrífuga, as cabezas de punta, as varillas de pipeta, os tanques de electroforese e os bancos experimentais implicados no experimento deben eliminarse completamente.
Nota 3:Os reactivos/disolucións implicados no experimento, especialmente auga, deben estar libres de RNase.
Disciplina 2:Bloquear a actividade dos encimas endóxenos
Nota 4:Escolle un método de homoxeneización adecuado.
Nota 5:Escolle un lisado adecuado.
Nota 6:Controla a cantidade inicial da mostra.
Disciplina 3:Aclara o teu propósito de extracción
Nota 7:Con calquera sistema de lisado que se aproxima á cantidade máxima inicial de mostra, a taxa de éxito da extracción cae drasticamente.
Nota 8:O único criterio económico para a extracción de ARN exitosa é o éxito en experimentos posteriores, non o rendemento.
As 10 principais fontes de contaminación por RNase
1. Os dedos son a primeira fonte de encimas esóxenas, polo que as luvas deben ser usadas e substituídas con frecuencia.Ademais, tamén se deben usar máscaras, porque a respiración tamén é unha fonte importante de encimas.Un beneficio adicional de usar unha máscara de luvas é protexer ao experimentador.
2. Puntas de pipeta, tubos de centrífuga, pipetas: a RNase non se pode inactivar só mediante esterilización, polo que as puntas de pipeta e os tubos de centrífuga deben tratarse con DEPC, aínda que estean marcados como tratados con DEPC.O mellor é usar unha pipeta de propósito especial, limpala cunha bóla de algodón ao 75% antes de usala, especialmente a vara;ademais, asegúrese de non usar un removedor de cabeza.
3. A auga/tampón debe estar libre de contaminación por RNase.
4. Polo menos, a mesa de proba debe ser limpada con boliñas de algodón ao 75 %.
5.RNase endóxena Todos os tecidos conteñen encimas endóxenos, polo que a conxelación rápida dos tecidos con nitróxeno líquido é a mellor forma de reducir a degradación.O método de almacenamento/moenda de nitróxeno líquido é realmente inconveniente, pero é o único xeito para os tecidos con altos niveis de encimas endóxenos.
6. Mostras de ARN Os produtos de extracción de ARN poden conter restos de contaminación por RNase.
7. Extracción de plásmidos A extracción de plásmidos adoita utilizar a Rnase para degradar o ARN, e a Rnase residual debe ser dixerida coa Proteinase K e extraída por PCI.
8. Almacenamento de ARN Aínda que se almacene a baixa temperatura, pequenas cantidades de RNase provocarán a degradación do ARN.A mellor solución para a conservación a longo prazo do ARN é unha suspensión de sal/alcohol, porque o alcohol inhibe toda a actividade enzimática a baixas temperaturas.
9. Cando os catións (Ca, Mg) conteñen estes ións, o quecemento a 80ºC durante 5 minutos fará que o ARN sexa escindido, polo que se é necesario quentar o ARN, a solución de conservación debe conter un axente quelante (citrato de sodio 1 mM, pH 6,4).
10. As encimas utilizadas en experimentos posteriores poden estar contaminadas pola RNase.
10 Consellos para a extracción de ARN
1: Evitar rapidamente a actividade da RNase.As mostras conxélanse rapidamente despois da recollida, e a RNase inactivase mediante unha operación rápida durante a lise.
2: Escolla un método de extracción adecuado para tecidos con alto contido de ribocimas e o tecido adiposo é mellor usar o método que contén fenol.
3: A calidade da predición require Northern, a construción da biblioteca de ADNc require unha gran integridade, e RT-PCR e RPA (ensaio de protección da ribonuclease) non requiren alta integridade.A RT-PCR require unha pureza elevada (residuos de inhibidores enzimáticos).
4: A homoxeneización completa é a clave para mellorar o rendemento e reducir a degradación.
5: Comprobe a integridade da detección de electroforese de ARN, 28S: 18S = 2: 1 é un sinal completo, 1: 1 tamén é aceptable para a maioría dos experimentos.
6: Eliminación de ADN para RT-PCR, análise de matriz É mellor usar a Dnase I para eliminar o ADN.
7: Reducir a contaminación de encimas esóxenos: os encimas non se poden importar do exterior.
8: Cando se concentra ácido nucleico de baixa concentración, debe engadirse un reactivo de coprecipitación.Pero para evitar que o co-precipitante conteña encimas e a contaminación do ADN.
9: Disolver completamente o ARN, se é necesario, quentar a 65ºC durante 5 minutos.
método de almacenamento adecuado
Pódese almacenar a –20 °C durante un breve período de tempo e a –80 °C durante moito tempo.O primeiro paso para mellorar os rendementos de ARN é entender que o contido de ARN das diferentes mostras varía moito.Alta abundancia (2-4ug/mg) como fígado, páncreas, corazón, abundancia media (0,05-2ug/mg) como cerebro, embrión, ril, pulmón, timo, ovario, baixa abundancia (<0,05ug/mg) mg) como vexiga, óso, graxa.
1: Lise as células para liberar RN: se non se libera ARN, o rendemento reducirase.A homoxeneización eléctrica funciona mellor que outros métodos de homoxeneización, pero pode que tamén teña que combinarse con outros métodos, como o puré de nitróxeno líquido, a dixestión enzimática (Lisozima/Liticase)
2: Optimización do método de extracción.Os maiores problemas cos métodos baseados en fenol son a estratificación incompleta e a perda parcial de ARN (o sobrenadante non se pode eliminar completamente).A estratificación incompleta débese ao alto contido de ácido nucleico e proteína, que se pode resolver aumentando a cantidade de lisado empregado ou reducindo a cantidade de mostra.Engadiuse un paso de extracción de cloroformo ao tecido adiposo.A perda de ARN pódese reducir mediante un bombeo inverso ou eliminando a capa orgánica seguida da centrifugación.O maior problema cos métodos baseados na centrifugación en columna é o exceso de mostra.
Consellos clásicos de extracción
1. Purificación de fenol: engade un volume igual de fenol/cloroformo 1:1 e mestúrase vigorosamente durante 1-2 minutos.Centrifugar a alta velocidade durante 2 minutos.Elimina coidadosamente o sobrenadante (80-90%).Nunca chegue á capa media.Pódese engadir un volume igual da solución de reacción a Fenol/Cloroformo e eliminar o sobrenadante.Os dous sobrenadantes pódense mesturar para a precipitación do ácido nucleico para mellorar o rendemento.Non sexa demasiado suave ao mesturar e non intente eliminar todo o sobrenadante.
2. Lavado con etanol ao 70-80%: durante o lavado, débese suspender o ácido nucleico para garantir que o sal residual sexa lavado.Ao mesmo tempo, inmediatamente despois de verter o etanol, centrifugue a alta velocidade durante uns segundos e, a continuación, elimine o etanol residual cunha pipeta.Disolver despois de estar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
11. Extracción de organizacións especiais
1. Tecido fibroso: a clave para a extracción de ARN do tecido fibroso como o músculo cardíaco/esquelético é interromper completamente o tecido.Estes tecidos teñen baixa densidade celular, polo que a cantidade de ARN por unidade de peso de tecido é baixa, e é mellor usar a cantidade inicial posible.Asegúrese de moer o tecido completamente en condicións de conxelación.
2. Tecidos con alto contido de proteína/graxa: o contido de graxa cerebral/vexetal é alto.Despois da extracción do PCI, o sobrenadante contén flóculos brancos.O sobrenadante debe ser extraído de novo con cloroformo.
3. Tecidos con alto contido en ácidos nucleicos/ribozimas: o bazo/timo ten alto contido en ácidos nucleicos e ribozimas.Moer o tecido en condicións de conxelación seguida dunha rápida homoxeneización pode inactivar eficazmente os ribozimas.Non obstante, se o lisado é demasiado viscoso (debido ao alto contido de ácido nucleico), a extracción do PCI non poderá estratificarse de forma eficaz;engadir máis lisado pode resolver este problema.As extraccións múltiples de PCI poden eliminar máis ADN residual.Se se forma un precipitado branco inmediatamente despois de engadir alcohol, indica contaminación do ADN.A re-extracción con PCI ácida despois da disolución pode eliminar a contaminación do ADN.
4. Tecido vexetal: o tecido vexetal é máis complexo que o tecido animal.Xeralmente, as plantas son moídas en condicións de nitróxeno líquido, polo que a degradación do ARN por encimas endóxenas é pouco común.Se o problema de degradación non se resolve, case con toda seguridade é causado polas impurezas contidas na mostra.As impurezas contidas en moitas plantas darán lugar a residuos, e a razón dos residuos adoita ser porque estas impurezas teñen algunhas semellanzas co ARN: ti precipitas e eu precipito, e ti adsorbes e eu adsorbo.Estas características determinan que sexan inhibidores enzimáticos moi fortes.
Na actualidade, os reactivos comerciais de extracción de ARN pódense adaptar a case todos os tecidos animais con pequenos axustes, pero hai poucos reactivos comerciais de extracción de ARN que poden ser axeitados para a maioría dos tecidos vexetais.Afortunadamente, Foregene pode ofrecer algo especialkits de extracción de ARN vegetal, temosKit de illamento de ARN total da planta, Kit de illamento de ARN total de plantas Plus.Este último está especialmente deseñado para plantas con alto contido en polisacáridos e polifenois.Para a extracción de ARN, os comentarios dos usuarios do laboratorio son particularmente bos.
12. O efecto da conxelación e desconxelación da mostra A mostra conxelada pode ser máis grande e debe ser cortada antes de usala para a extracción de ARN.As mostras tenden a fundirse (posiblemente parcialmente) durante o corte.As mostras conxeladas poden ter que pesarse antes da extracción de ARN, e a desconxelación producirase definitivamente durante este proceso.Ás veces, a desconxelación da mostra tamén se produce durante o proceso de moenda de nitróxeno líquido;ou a mostra conxelada engádese directamente ao lisado sen moler nitróxeno líquido, e a desconxelación producirase definitivamente antes da homoxeneización completa.Os experimentos demostraron que o tecido conxelado é máis propenso á degradación do ARN durante a desconxelación que o tecido fresco.O motivo probable: o proceso de conxelación e desconxelación altera as estruturas dentro da célula, facilitando que os encimas endóxenos entren en contacto directo co ARN.
13. Xuízo da calidade do ARN Normalmente, a electroforese utilízase para xulgar a integridade do ARN, e A260/A280 úsase para xulgar a pureza do ARN.En teoría, o ARN intacto ten unha proporción de 28S:18S = 2,7:1, e a maioría dos datos enfatizan a proporción de 28S:18S = 2:1.O caso é que case ningún dos ARN extraídos de mostras que non sexan células está nunha proporción de 2:1 (obtívose mediante o Agilent Bioanalyzer).
Os resultados da electroforese do ARN están afectados por moitos factores, incluíndo a estrutura secundaria, as condicións da electroforese, a carga da mostra, o grao de saturación por EB, etc. Use a electroforese nativa para detectar o ARN e use o marcador de ADN como control.Se o 28S a 2 kb e o 18S a 0,9 kb son claros e 28S: 18S > 1, a integridade pode cumprir os requisitos da maioría dos experimentos posteriores.
A260/A280 é un indicador que causou moita confusión.En primeiro lugar, é necesario aclarar o significado orixinal deste indicador para os ácidos nucleicos: ARN puro, o seu A260/280 = aproximadamente 2,0.O ARN puro é a "causa" e A260/A280 = 2 é o "efecto".Agora todo o mundo está a usar A260/A280 como "causa", pensando que "se A260/A280 = 2, entón o ARN é puro", o que naturalmente leva á confusión.
Se estás interesado, podes engadir un pouco de reactivo que se usa a miúdo na extracción, como fenol, isotiocianato de guanidina, PEG, etc., á túa mostra de ARN e despois medir a relación A260/A280.A realidade é que moitos dos reactivos utilizados para a extracción de ARN, así como moitas impurezas da mostra, absorben ao redor de A260 e A280, afectando a A260/A280.
O enfoque máis instrutivo na actualidade é escanear mostras de ARN no intervalo de 200-300 nm.A curva do ARN puro ten as seguintes características: a curva é suave, A230 e A260 son dous puntos de inflexión, A300 está preto de 0, A260/A280 = arredor de 2,0 e A260/A230 = arredor de 2,0.Se os datos de exploración non están dispoñibles, tamén se debe determinar a relación A260/A230, xa que esta relación é máis sensible ao arrastre de todas as impurezas que afectan á reacción enzimática.Teña en conta o rango lineal do dispositivo (0,1-0,5 para A260).
Hai outros dous fenómenos útiles: a relación será uns 0,3 menor cando A260/A280 se mide en auga;mentres que a relación medida en EDTA 10 mM é uns 0,2 máis alta que a medida en EDTA 1 mM.
Produtos relacionados:
Fabricante e provedor do kit de illamento de ARN total da planta de China |Foregene (foreivd.com)
Serie de illamento de ARN - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Hora de publicación: 15-Xul-2022
