Especificidade da detección
Na maioría dos casos, o propósito do deseño de cebadores é maximizar a especificidade da PCR.Isto vén determinado pola influencia máis ou menos previsible de moitas variables.Unha variable importante é a secuencia no extremo 3′ do cebador.
É importante destacar que os ensaios de PCR deseñados para a especificidade teñen máis probabilidades de manter unha alta eficiencia nun amplo rango dinámico, porque o ensaio non produce produtos de amplificación inespecíficos, polo que compite cos reactivos de PCR ou inhibe a reacción de amplificación principal.
Por suposto, nalgúns casos, a especificidade non é o máis importante, por exemplo, cando o obxectivo é cuantificar patóxenos moi relacionados pero diferentes, son necesarios estándares especiais de deseño, optimización e verificación.
A curva de fusión é un método estándar para avaliar a especificidade dos amplicóns, polo menos en termos de amplificar un só obxectivo.Non obstante, hai que subliñar que as curvas de fusión poden ser enganosas porque, por exemplo, poden verse afectadas polos efectos combinados de cebadores subóptimos e baixas concentracións de molde.
P5 |A curva de fusión mostra os desprazamentos de Tm obtidos a partir de dúas deteccións de diferentes cantidades de dous ADN diana.
A. En concentracións máis altas (ad)), non hai un dímero de cebador obvio despois de que se complete a medición de qPCR.A medida que a concentración do modelo diminúe a 50 copias (e), comeza a aparecer un produto inespecífico e pasa a ser o único produto coa concentración máis baixa (f).
B. A proba rexistrou os mesmos Tms en todas as concentracións obxectivo, e non houbo un dímero de cebador obvio mesmo na concentración máis baixa (5 copias).Ao utilizar estes dous métodos de detección, non se detectaron produtos de amplificación nos NTC.
P5 mostra as curvas de disolución obtidas con mostras nas que o molde está presente a diferentes concentracións.P 5a mostra que nas dúas concentracións máis baixas, as Tms dos produtos de amplificación inespecíficos producidos son inferiores á dos amplicóns específicos.
Obviamente, este método de detección non se pode utilizar de forma fiable para detectar obxectivos que existen en baixas concentracións.
Curiosamente, os NTC, é dicir, as mostras sen ADN en absoluto, non rexistraron produtos de amplificación (non específicos), o que indica que o ADN xenómico de fondo pode participar na amplificación/polimerización non específica.
Ás veces, tales cebadores de fondo e amplificación inespecífica non se poden remediar, pero moitas veces é posible deseñar un método de detección que non teña amplificación inespecífica en ningunha concentración de molde e NTC (P 5b).
Aquí, mesmo rexistrar a amplificación da concentración diana cun Cq de 35 producirá unha curva de disolución específica.Do mesmo xeito, os NTC non mostraron signos de amplificación inespecífica.Ás veces, o comportamento de detección pode depender do licor nai, e só se detecta a amplificación inespecífica en certas composicións tampón, que poden estar relacionadas con diferentes concentracións de Mg2+.
Estabilidade da detección
A optimización de Ta é un paso útil no proceso de verificación empírica e optimización da detección de qPCR.Proporciona unha indicación directa da robustez do conxunto de cebadores mostrando a temperatura (ou rango de temperatura) que produce o Cq máis baixo sen amplificar o NTC.
A diferenza entre dúas e catro veces na sensibilidade pode non ser importante para as persoas con alta expresión de ARNm, pero para as probas de diagnóstico, pode significar a diferenza entre resultados positivos e falsos negativos.
As propiedades Ta dos cebadores de qPCR poden variar moito.Algunhas probas non son moi robustas, e se non se realizan baixo o valor Ta óptimo dos cebadores, colapsarán rapidamente.
Isto é importante porque este tipo de detección adoita ser problemático no mundo real, e a pureza da mostra, a concentración de ADN ou a presenza doutro ADN poden non ser óptimas.
Ademais, o número de copias de destino pode variar nun amplo intervalo, e os reactivos, utensilios de plástico ou instrumentos poden ser diferentes dos utilizados ao configurar a proba.
P6|O gradiente de temperatura mostra a diferente robustez da detección por PCR.
A. Use a mestura principal Sensifast SYBR de Bioline (número de catálogo BIO-98050) para realizar a PCR sobre ADNc preparado a partir de ARN do cerebro humano.
B. Use o instrumento CFX qPCR de Bio-Rad para rexistrar o mapa de amplificación e a curva de disolución do apaleno (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Gráfico de amplificación e curva de fusión de ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Gráfico de amplificación e curva de disolución de GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs rexistrados a diferentes temperaturas de recocido, mostrando a diferenza de Cq rexistrada baixo un gradiente de temperatura de 7C.
P 6 mostra un resultado típico dunha proba non desexada, na que se realizou qPCR usando un gradiente Tas entre 59C e 67C (P 6a), utilizando cebadores para tres xenes específicos do cerebro humano.
Pódese ver no gráfico de amplificación que os cebadores de Opalin están lonxe de ser ideais porque o seu intervalo de Ta óptimo é moi estreito (Figura 6b), é dicir, os Cqs están amplamente dispersos, polo que os Cqs se comparan significativamente cos seus Cqs Low óptimos.
Este método de detección é inestable e pode levar a unha amplificación subóptima.Polo tanto, este par de cebadores debería redeseñar.Ademais, a análise da curva de fusión (inserto) mostra que a especificidade deste método de detección tamén pode ser problemática, porque a curva de fusión de cada Ta é diferente.
O método de detección ACSBG1 mostrado en P 6c é máis robusto que o método de detección de Opalin anterior, pero aínda está lonxe de ser o ideal, e é probable que se poida mellorar.
Non obstante, subliñamos que non existe unha conexión necesaria entre robustez e especificidade, porque a curva de disolución producida por este método de detección mostra o mesmo valor pico en todas as Tas (inserto).
Por outra banda, a proba de robustez é moito máis tolerante, producindo Cq semellantes nunha ampla gama de Tas, como na proba GFAP mostrada en P 6d.
A diferenza de Cqs obtida no mesmo intervalo de 8 graos Celsius é inferior a 1, e a curva de disolución (inserto) confirma as características de detección neste intervalo de temperatura.Paga a pena notar que o Tas calculado e o intervalo de Ta real poden ser moi diferentes.
Existen moitas directrices deseñadas para axudar aos investigadores a deseñar cebadores eficientes, a maioría dos cales baséanse en regras establecidas desde hai moito tempo e prestouse moita atención ao extremo 3 dos cebadores.A miúdo recoméndase incluír unha G ou C no extremo 3' e dúas bases G ou C (abrazadeira GC), pero non máis de dúas das últimas 5 bases.
Na práctica, estas regras poden orientar aos investigadores, pero non son necesariamente correctas en todas as circunstancias.
P7 |O extremo 3 do cebador ten pouco efecto sobre a especificidade ou a eficiencia.
A. A posición dos cebadores do xene HIF-1α humano (NM_181054.2).
B. Use o licor nai Agilent Brilliant III SYBR Green (núm. cat. 600882) para amplificar seis elementos de proba.
C. Gráfico de amplificación e curva de fusión rexistrados polo instrumento CFX qPCR de Bio-Rad e cebadores de extremo 3′.Os NTC móstranse en vermello.
D. Cqs rexistro de cada elemento da proba
Por exemplo, o resultado en P 7 contradí a regra do extremo 3'.Todos os deseños producen basicamente os mesmos resultados, con só dúas combinacións de cebadores que conducen a unha amplificación non específica en NTC.
Non obstante, non podemos apoiar o efecto do clip GC, porque neste caso, usar A ou T como máximo de 30 bases non reduce a especificidade.
A proba C, onde o cebador F remata en GGCC, rexistrou Cq en NTC, o que indica que se pode querer evitar estas secuencias no extremo 30.Subliñamos que o único xeito de determinar a mellor secuencia do extremo 3' dun par de cebadores é avaliar experimentalmente algúns cebadores candidatos.
Eficiencia de amplificación
É importante destacar que, aínda que a detección inespecífica da PCR nunca pode chegar a ser específica, a eficiencia da amplificación pódese axustar e maximizar de moitas formas diferentes cambiando o encima, o licor nai, os aditivos e as condicións de ciclo.
Para avaliar a eficiencia da detección por PCR, é mellor usar unha dilución en serie de 10 ou 5 veces o ácido nucleico obxectivo, é dicir, o "método de curva estándar".
Se se usan amplicóns de PCR ou dianas de ADN sintético para xerar unha curva estándar, as dilucións en serie destes obxectivos deben mesturarse cunha cantidade constante de ADN de fondo (como o ADN xenómico).
P8 |Curva de dilución para avaliar a eficiencia da PCR.
A. Use cebadores para HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA e R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC e a mestura mestra Brilliant III SYBR Green de Agilent (número de catálogo 600882) para PCR e condicións de curva de fusión.
B. Transcribíronse 100 ng de ARN, diluíronse 2 veces e as mostras de ADNc diluídas en serie diluíronse 5 veces ata 1 ng de ADN xenómico humano.A curva de fusión móstrase no recuadro.
C. A reacción RT, a dilución e a dilución en serie repitéronse para a segunda mostra de ADNc e os resultados foron similares.
P 8 mostra dúas curvas estándar, usando o mesmo método de detección en dúas mostras de ADNc diferentes, o resultado é a mesma eficiencia, preto do 100%, e o valor R2 tamén é similar, é dicir, o grao de axuste entre os datos experimentais e a liña de regresión ou o grao de linealidade dos datos.
As dúas curvas estándar son comparables, pero non exactamente iguais.Se o propósito é cuantificar con precisión o obxectivo, hai que ter en conta que é inaceptable proporcionar un cálculo do número de copias sen explicar a incerteza.
P9 |Incertidumbre de medida asociada á cuantificación mediante unha curva estándar.
A. Use cebadores para GAPDH (NM_002046) para realizar a PCR e as condicións da curva de fusión.F: ACAGTTGCCATGTAGACC e R: TAACTGGTTGAGCACAGG e Mastermix Sensifast SYBR de Bioline (número de catálogo BIO-98050).
B. Gráfico de amplificación, curva de fusión e curva estándar rexistrados co instrumento CFX qPCR de Bio-Rad.
C. Gráfico de curva estándar e intervalo de confianza (IC) do 95 %.
D. O número de copias e o intervalo de confianza do 95 % dos tres valores de Cq derivados da curva de dilución.
P 9 mostra que para unha proba optimizada, a variabilidade inherente dunha única curva estándar é de aproximadamente 2 veces (intervalo de confianza do 95%, de mínimo a máximo), que pode ser a menor variabilidade que se pode esperar.
Produto relacionado:
Kit de PCR directa de tecido animal
Hora de publicación: 30-09-2021
