O experimento de RT-qPCR inclúe a extracción de ARN e a avaliación da calidade, a transcrición inversa e a qPCR tres pasos, cada paso ten moitas precaucións, que imos introducir en detalle a continuación.

Ⅰ.Avaliación da calidade do ARN

No experimento RT-qPCR, despois de completar a extracción de ARN, a calidade do ARN debe ser avaliada, e o experimento de seguimento só se pode levar a cabo despois de ser cualificado.Os métodos de avaliación inclúen o espectrofotómetro, a electroforese en xel Agilent, a análise Agilent 2100, entre os que se atopan o espectrofotómetro máis utilizado e a detección do método de electroforese en xel de agarosa.Cómpre sinalar que estes dous métodos deben usarse xuntos para completar a detección e análise da concentración, pureza e integridade do ARN, co fin de garantir a calidade do ARN.

Kit de illamento de ARN relacionado: 

Kit de illamento de ARN total celular

Pódese obter ARN total altamente purificado e de alta calidade a partir de varias células cultivadas en 11 min.

Kit de illamento de ARN total animal

Extrae de forma rápida e eficiente ARN total de alta pureza e alta calidade de varios tecidos animais.

Espectrofotómetro:

O espectrofotómetro úsase principalmente para determinar a concentración e pureza do ARN, pero non pode detectar a integridade do ARN e os residuos xenómicos.Entre eles, A260/280 e A260/230 son parámetros importantes para a detección da pureza do ARN, e a pureza do ARN pódese detectar segundo a flutuación dos seus valores:

1. 1,9< A260/280< 2,1, o que indica que a pureza do ARN é boa;A260/280<1,9, o que indica que pode haber residuos de proteínas no ARN;A260/280>2.1, indicando unha posible degradación parcial do ARN, que se pode confirmar aínda máis mediante electroforese en xel de agarosa.

2. 2.0< A260/230< 2.2, o que indica que a pureza do ARN é boa;A260/230< 2,0, indicando que pode haber residuos de reactivos orgánicos no ARN, como fenois, etanol ou azucres.

Electroforese en xel de agarosa:

O ensaio de electroforese en xel de agarosa pode analizar a integridade do ARN, o xenoma e os residuos de proteínas, pero non poden cuantificar con precisión a concentración de ARN nin detectar os residuos de reactivos orgánicos.Tome modelos de ARN eucariotas, por exemplo:

1. O ARN foi sometido a electroforese en xel de agarosa.Se só había tres bandas únicas de 28sRNA, 18sRNA e 5.8sRNA no mapa do xel, indica que o ARN extraído está intacto.Se hai un fenómeno de arrastre, indica unha degradación parcial do ARN.

2. Se hai unha única banda brillante entre o burato de cola e a banda de ARNs 28, pode haber un residuo de ADN xenómico.

3. Se aparecen bandas no burato de cola, indica que pode haber residuos de proteínas e outras substancias macromoleculares.

Ⅱ. Transcrición inversa

Despois de completar a extracción de ARN, é necesario inverter en ADNc para experimentos posteriores, polo que o paso de reversión é esencial.A transcrición inversa introducirase a partir da selección da transcriptase inversa e do cebador:

Selección de transcriptase inversa:

As transcriptases inversas típicas inclúen AMV RTase e MMLV RTase.A RNase H da AMV RTase ten unha forte actividade, curta duración de síntese, baixa cantidade de síntese e boa estabilidade térmica (42 ~ 55 ℃).A actividade da RNase H da MMLV RTase é débil, a lonxitude da síntese é longa, a cantidade de síntese é alta e a estabilidade térmica é pobre (37 ~ 42 ℃).

Dado que a enzima RNase H ten a función de degradar o molde de ARN, os MMLV cunha actividade RNase H débil deberían seleccionarse preferentemente durante a transcrición inversa, e despois da enxeñaría xenética, a estabilidade térmica do MMLV alcanzou un salto cualitativo.Tomando ForegeneTranscriptase inversa Foreasy (M-MLV para transcrición inversa) como exemplo, é unha nova transcriptase inversa expresada en bacterias modificadas por E. coli mediante tecnoloxía de recombinación xenética.É unha ADN polimerase recombinante que sintetiza unha cadea de ADN complementaria a partir de ARN monocatenario, ADN ou un híbrido ARN:ADN.Non ten actividade RNase H, forte estabilidade, forte afinidade polo ARN e alta sensibilidade de detección.

 

Transcriptase inversa Foreasy (M-MLV para transcrición inversa)

Selección de imprimación:

Xeralmente os cebadores RT divídense en tres categorías: oligo dT, cebadores aleatorios e cebadores específicos de xenes.Seleccione cebadores axeitados para o seu uso segundo os diferentes requisitos experimentais.

1. Se o molde é de orixe eucariota e se usa o ADNc tardío para a amplificación de PCR rutineira, recoméndase Oligo (dT);Se o experimento posterior só se usa para qPCR, recoméndase mesturar Oligo (dT) con cebadores aleatorios para mellorar a eficiencia da transcrición inversa.

2. Se o modelo é de procariotas, deben seleccionarse cebadores aleatorios ou cebadores específicos de xenes para a transcrición inversa.

Ⅲ.qPCR

A cuantificación de fluorescencia elabórase principalmente a partir da selección de métodos cuantitativos, principios de deseño de cebadores, selección de ROX, configuración do sistema de reacción e axuste das condicións de reacción, etc.

Selección de métodos cuantitativos:

Os métodos cuantitativos divídense en métodos cuantitativos relativos e métodos cuantitativos absolutos.A cuantificación relativa pódese usar para detectar o efecto de certos métodos de tratamento sobre a expresión xénica, detectar a diferenza de expresión xénica en diferentes momentos e comparar a diferenza de expresión xénica en diferentes tecidos.A cuantificación absoluta pode detectar a cantidade de ácido nucleico no virus, etc.Ao facer experimentos, debemos escoller os métodos cuantitativos axeitados segundo os nosos propios experimentos.

Principios de deseño inicial:

O deseño do cebador para qPCR está directamente relacionado coa eficiencia da amplificación e a especificidade do produto.Polo tanto, deseñar correctamente bos cebadores é o primeiro paso do qPCR exitoso.No deseño de imprimación, débese prestar atención aos seguintes principios cando se cumpra o principio de deseño de imprimación convencional:

1. A lonxitude do fragmento obxectivo está controlada entre 100 e 300 pb;

2. Deseño de exóns cruzados para evitar a influencia do ADN xenómico;

3. Os cebadores deseñados deben ser probados para a eficiencia de amplificación, e só cando a eficiencia de amplificación alcanza o estándar (90-110%) poden usarse para experimentos cuantitativos;

4. A concentración de imprimación adoita optimizarse entre 0,1 uM e 1,0 uM.

Selección deROX:

No proceso de reacción cuantitativa, ROX pode axustar uniformemente a diferenza do camiño óptico, o erro de pipeteo ou a diferenza de volume causada pola evaporación e a condensación, mellorando a repetibilidade dos resultados.Non obstante, hai que ter en conta que a selección de ROX está relacionada co instrumento.Se o instrumento qPCR ten a función de corrixir automaticamente a diferenza entre os buracos, non é necesario engadir ROX;en caso contrario, debe engadir a corrección ROX.Os pequenos socios na compra de reactivos deben ser de acordo co instrumento utilizado para escoller o ROX correcto, evitando erros posteriores.

Preparación do sistema de reacción:

Prefírense volumes de reacción de 20 ul e 50 ul.Cando se formula o sistema, debe prestarse atención aos seguintes aspectos:

1. O sistema de reacción debe prepararse mediante ventilación no banco de traballo ultralimpo, novo ddH₂O úsase para cada experimento;

2. Cada experimento debe preparar NTC para verificar se hai contaminación no sistema, e cada par de cebadores debe facer NTC ao preparar o sistema;

3. Para detectar se hai residuo de ADNg no molde de ARN, pódese preparar NRT para cada mostra para a súa detección;

4. Ao preparar o sistema, recoméndase facer polo menos 3 repeticións técnicas para unha mostra;

5. Cando o modelo é ADNc, recoméndase diluír 5-10 veces para reducir o efecto inhibidor do sistema de transcrición inversa no experimento qPCR.É mellor explorar a cantidade de modelo por gradiente, para que o valor CT caia entre 20-30;

6. Determine o número necesario de reaccións, aumente nun 5-10% en función do número de reaccións e calcule o número de configuración do volume;

7, o sistema prepárase usando o principio de premestura, mesturando despois da centrifugación e garantir que non haxa burbullas;

8, na medida do posible, escoller consumibles de apoio.

Kit RT-qPCR relacionado