A RT-qPCR é o experimento básico da bioloxía molecular, e todos deben estar familiarizados con el.Principalmente inclúe tres pasos: extracción de ARN, transcrición inversa en cDNA e PCR cuantitativa fluorescente en tempo real.Non axuda, que está a pasar?É probable que haxa un problema conexperimento de transcrición inversa!Aínda que parece que o experimento de transcrición inversa só precisa engadir ARN, dNTP, cebadores etranscriptase inversaao tubo da centrífuga e mestura ben, pero no proceso de operación real, aínda hai moitos detalles aos que hai que prestar atención.Imos aprender sobre iso!

Como xulgar a calidade do ARN?
Para obter cDNA, a calidade do ARN é fundamental!A calidade do ARN pódese detectar principalmente desde dous aspectos:
(1) Integridade do ARN:A integridade do ARN pódese verificar mediante electroforese en xel de agarosa. Tomando os eucariotas como exemplo, o ARN total completo ten tres bandas claras, os pesos moleculares de grandes a pequenos son 28S, 18S e 5S, e 28S é o dobre de brillante que 18S;se poden ver tres bandas, pero o tipo de banda está borroso ou Difusión significa que o ARN está parcialmente degradado.Neste momento, realice inmediatamente a reacción de transcrición inversa e aumente a entrada do modelo adecuadamente;se só se pode ver unha banda cun peso molecular pequeno ou ningunha banda, o ARN foi completamente degradado e debe ser extraído de novo.Agilent 2100 indica a integridade do ARN co diagrama de picos e o valor RIN.Se o ácido nucleico está intacto, a liña base do electroferograma é plana;se o ácido nucleico está severamente degradado, a liña de base é irregular e aparecen máis picos de degradación;o valor de RIN reflicte a integridade do ARN, dentro do intervalo de 0-10, canto maior sexa o valor, mellor será a calidade do ARN.Ben, canto maior sexa o grao de integridade.
(2) Pureza do ARN:A relación de OD260/280 pódese detectar mediante espectrofotometría UV.Se a relación de OD260/280 está entre 1,9 e 2,1, a pureza é moi boa.
O ADN xenómico residual pode levar a resultados cuantitativos inexactos
Cando se extrae o ARN, o ARN que obtemos pode mesturarse con ADN xenómico (ADNg) que non foi limpo.Polo tanto, o ADNc despois da transcrición inversa tamén se mesturará congDNA.Durante o río abaixoqPCRreacción,cDNAe o ADNg pódense amplificar simultáneamente, dando como resultado un valor de TC relativamente pequeno, polo que os resultados poden estar sesgados.
Entón, que debemos facer nesta situación?Forexenesuxire:
(1) Realice a limpeza do xenoma no ARN invertido, que se pode eliminar mediante a extracción da columna durante a extracción do ARN;
(2) Tratar o ARN extraído con DNaseI , pero finalizalo con EDTA;
de reactivos de transcrición inversacon módulos de limpeza do xenoma;

Como elixir cebadores para a transcrición inversa?
Os cebadores de transcrición inversa tamén afectan o resultado da reacción de transcrición inversa.Podes escoller cebadores aleatorios, Oligo dT ou cebadores específicos de xenes para a transcrición inversa segundo as circunstancias específicas do experimento:
(1) Transcricións específicas: recoméndanse cebadores específicos de xenes;
(2) Transcricións de fragmentos longos: Recoméndanse cebadores Oligo dT/específicos de xenes;
(3) Fragmentos internos de transcricións de segmentos longos: cebadores específicos de xenes/ cebadores aleatorios / cebadores aleatorios + Oligo dT.Se se realiza o experimento de qPCR posterior, Oligo dT non se pode usar só, porque o uso de Oligo dT só pode provocar un sesgo de extremo 3′, o que provoca resultados do experimento de qPCR imprecisos;
(4) miARN: Pódense usar cebadores de bucle de tallo ou cebadores de cola.

Cantas veces se debe diluír o ADNc do produto de transcrición inversa para a súa cuantificación?
Despois de obter o ADNc do produto de transcrición inversa, cantas veces se debe diluír o ADNc para experimentos de qPCR é moi importante.Se a concentración de ADNc é demasiado alta ou moi baixa, a eficiencia da amplificación pode verse afectada.Pódese medir a concentración de ADNc e como se debe facer?
(1) Non se pode medir a concentración de ADNc do produto de transcrición inversa porque, ademais do produto de ADNc, o produto de transcrición inversa tamén contén tampón residual de transcrición inversa, transcriptase inversa, cebadores, etc., o que interferirá cos resultados da medición da concentración e provocará que a relación OD260/280, OD260/230 non reflicta un cDNA verdadeiro e, polo tanto, non reflicte un cDNA verdadeiro.Neste momento, dirán algúns amigos, entón medirei a concentración despois da purificación;Aquí, Foregene quere lembrar que non se recomenda purificar o ADNc, porque a lonxitude do ADNc obtido pola reversión é diferente e o ADNc curto perderase na purificación.
(2) Entón, que facer?Antes do experimento de qPCR, o gradiente de dilución do cDNA pódese determinar mediante o preexperimento.Por exemplo: use a solución stock de ADNc, a dilución de 10 veces e a dilución de 100 veces como modelos para experimentos de qPCR e seleccione o factor de dilución cun valor CT no intervalo de 18-28.

Como se deben transcribir inversamente os miARN?
O miARN é un ARN de molécula pequena monocatenaria cun tamaño duns 22 nt que non codifica proteínas.Debido á súa curta duración, o método qPCR convencional é difícil de cuantificalo directamente, polo que moitas veces é necesario estender o miARN;os métodos de transcrición inversa comúnmente usados ​​para miARN inclúen o método de bucle de talo e o método de cola.
O método stem-loop consiste en estender o miARN engadindo cebadores stem-loop.Este método de detección ten unha maior sensibilidade e especificidade, pero o rendemento de detección é baixo.Unha transcrición inversa só pode detectar un miARN e unha referencia interna;o método de adición de cola componse de dous. Complétase coa acción conxunta de dous encimas, que son a polimerase PolyA e a transcriptase inversa.A poliA polimerase é a responsable de engadir colas de PolyA ao miARN para aumentar a súa lonxitude, e a transcriptase inversa realiza a reacción de transcrición inversa.Este método ten un alto rendemento de detección e pode detectar múltiples miRNAs e referencias internas nunha soa transcrición inversa, pero a sensibilidade e especificidade son baixas no método de bucle de tronco.