A PCR cuantitativa de fluorescencia (tamén coñecida como PCR TaqMan, en diante FQ-PCR) é unha nova tecnoloxía cuantitativa de ácidos nucleicos desenvolvida por PE (Perkin Elmer) nos Estados Unidos en 1995. Esta tecnoloxía baséase na PCR convencional engadindo sondas marcadas fluorescentes.En comparación coa PCR flexible, a FQ-PCR ten moitas vantaxes para realizar a súa función cuantitativa.Este artigo pretende describir brevemente as características, principios, métodos e aplicacións da tecnoloxía.
1 Características
A FQ-PCR non só ten a alta sensibilidade da PCR ordinaria, senón que, debido á aplicación de sondas fluorescentes, pode detectar directamente o cambio de sinal fluorescente durante a amplificación da PCR a través do sistema de condución fotoeléctrica para obter resultados cuantitativos, o que supera moitas deficiencias da PCR convencional, polo que tamén ten a alta especificidade da hibridación de ADN e a alta precisión da tecnoloxía de espectroscopia.
Por exemplo, os produtos xerais de PCR deben observarse mediante electroforese en xel de agarosa e tinción con bromuro de etidio con luz ultravioleta ou mediante electroforese en xel de poliacrilamida e tinción con prata.Isto non só require varios instrumentos, senón que tamén leva tempo e esforzo.As manchas usadas de bromuro de etidio son prexudiciais para o corpo humano, e estes complicados procedementos experimentais ofrecen oportunidades de contaminación e falsos positivos.Non obstante, a FQ-PCR só precisa abrir a tapa unha vez durante a carga da mostra, e o proceso posterior é unha operación de tubo completamente pechado, que non require o procesamento posterior da PCR, evitando moitos inconvenientes nas operacións de PCR convencionais.O experimento usa xeralmente o termociclador ABI7100 PCR desenvolvido pola empresa PE.
O instrumento ten as seguintes características: ① Ampla aplicación: pódese usar para a cuantificación de produtos de PCR de ADN e ARN, investigación da expresión xénica, detección de patóxenos e optimización das condicións de PCR.② Principio cuantitativo único: usando sondas marcadas con fluorescencia, a cantidade de fluorescencia acumularase co ciclo de PCR despois da excitación con láser, para conseguir o propósito da cuantificación.③ Alta eficiencia de traballo: termociclador 9600 PCR integrado, controlado por ordenador de 1 a 2 horas para completar a amplificación e cuantificación de 96 mostras de forma automática e sincronizada.④ Non é necesario electroforese en xel: non é necesario diluír e electroforese a mostra, só tes que usar unha sonda especial para detectar directamente no tubo de reacción.⑤Non hai contaminación no gasoduto: adóptanse o tubo de reacción único e totalmente pechado e o sistema de condución fotoeléctrica, polo que non hai que preocuparse pola contaminación.⑥Os resultados son reproducibles: o rango dinámico cuantitativo é de ata cinco ordes de magnitude.Polo tanto, dado que esta tecnoloxía foi desenvolvida con éxito, foi valorada por moitos investigadores científicos e aplicouse en moitos campos.
2 Principios e métodos
O principio de funcionamento da FQ-PCR é utilizar a actividade exonuclease 5′→3′ do encima Taq para engadir unha sonda marcada fluorescente ao sistema de reacción da PCR.A sonda pode hibridar especificamente co molde de ADN contido na secuencia do cebador.O extremo 5 da sonda está marcado co xene de emisión de fluorescencia FAM (6-carboxifluoresceína, pico de emisión de fluorescencia a 518 nm), e o extremo 3 está marcado con O grupo de extinción da fluorescencia TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina, sonda de emisión de fluorescencia de 5832'beak de fosforescencia a 583'beak para evitar que a sonda se estenda durante a amplificación por PCR.Cando a sonda permanece intacta, o grupo quencher suprime a emisión de fluorescencia do grupo emisor.Unha vez que o grupo emisor está separado do grupo de extinción, a inhibición elévase e a densidade óptica a 518 nm aumenta e é detectada polo sistema de detección de fluorescencia. Na fase de renaturalización, a sonda hibrida co ADN molde, e o encima Taq na fase de extensión móvese ao longo da plantilla de ADN coa extensión do cebador.Cando a sonda é cortada, o efecto de extinción é liberado e o sinal fluorescente é liberado.Cada vez que se copia o modelo, córtase unha sonda, acompañada da liberación dun sinal fluorescente.Dado que existe unha relación un a un entre o número de fluoróforos liberados e o número de produtos de PCR, esta técnica pódese usar para cuantificar con precisión o molde.O instrumento experimental xeralmente usa o termociclador ABI7100 PCR desenvolvido pola empresa PE, e tamén se poden usar outros termocicladores.Se para o experimento se usa o sistema de reacción de tipo de reacción ABI7700, despois de completar a reacción, os resultados cuantitativos pódense dar directamente a través da análise por ordenador.Se usa outros termocicladores, cómpre utilizar un detector de fluorescencia para medir o sinal de fluorescencia no tubo de reacción ao mesmo tempo para calcular RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ representa a relación entre a intensidade de luminiscencia do grupo de emisión fluorescente do tubo de mostra e a intensidade de luminiscencia do grupo de extinción, RQ- representa a relación entre os dous no tubo en branco, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) representa a cantidade de cambio de sinal de fluorescencia durante a PCR.Debido á introdución de sondas fluorescentes, a especificidade do experimento mellora significativamente.O deseño da sonda xeralmente debe cumprir as seguintes condicións: ①A lonxitude da sonda debe ser dunhas 20-40 bases para garantir a especificidade da unión.②O contido das bases GC está entre o 40% e o 60% para evitar a duplicación de secuencias de nucleótidos únicos.③ Evite a hibridación ou a superposición con cebadores.④ A estabilidade da unión entre a sonda e o modelo é maior que a estabilidade da unión entre o cebador e o modelo, polo que o valor de Tm da sonda debe ser polo menos 5 °C superior ao valor de Tm do cebador.Ademais, a concentración da sonda, a homoloxía entre a sonda e a secuencia plantilla e a distancia entre a sonda e o cebador teñen un impacto nos resultados experimentais.
Produtos relacionados:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Fabricante e provedor |Foregene (foreivd.com)
Hora de publicación: 15-Oct-2021
