RNase é unha palabra sensible que moitos estudantes que adoitan realizar experimentos de extracción de ARN non queren escoitar.Completamente armado, o ARN que finalmente foi extraído cos reactivos altamente tóxicos fenol e cloroformo foi degradado.Non estou reconciliado!!!Hoxe, vexamos a orixe da famosa Rnase.

A ribonuclease (RNase), ou RNase, é unha nuclease que pode hidrolizar o ARN en pequenas moléculas.A RNase, como proteína de molécula pequena, é inusualmente estable .A esterilización convencional por vapor a alta temperatura e a alta presión e os inhibidores de proteínas non poden inactivalo completamente.A estabilidade da RNase provén principalmente dos enlaces disulfuro da estrutura.Por exemplo, a RNase de uso común do páncreas bovino ten só 124 aminoácidos, pero contén 4 enlaces disulfuro.O enlace de xofre e o enlace disulfuro dotan á RNase dunha excelente estabilidade térmica.Ademais, a rnase ten un peso molecular relativamente pequeno e pode restaurar rapidamente a súa conformación orixinal en moitos casos.

Ademais de ser extremadamente estable,As RNases son omnipresentes no laboratorio .A RNase é un mecanismo de defensa biolóxica.Para unha célula, o ARN esóxeno adoita ser fatal.En comparación co ADN esóxeno, o ARN esóxeno adoita ser máis perigoso.O ARN transcríbese e tradúcese felizmente, polo que case todos os organismos desenvolveron RNases para defenderse da invasión do ARN esóxeno.Polo tanto, as células bacterianas cultivadas no laboratorio e ti que extraes ARN exudan o aroma da RNase.Os fluídos do corpo humano (saliva, bágoas, etc.) conteñen unha gran cantidade de RNase, polo que non chores cando o ARN se degrada.Canto máis choras, peor será a degradación do ARN!!A irmá Daiyu non é apta para a extracción de ARN.

Ademais, a túa delicada pel tamén contén moita RNase, e os marcadores, pipetas, portas do frigorífico e asas das portas que foron tocadas pola pel tamén conteñen RNase.

Con tanta divagación, vexamos como tratar coas RNases.

O primeiro no que todos pensan ao eliminar o ARN éDEPC(pirocarbonato de dietilo).A DEPC desnaturaliza principalmente a proteína combinándose co anel imidazol do grupo activo da RNase histidina, inhibindo así a actividade do encima.O DEPC do 0,1% pode ter un mellor efecto de eliminación sobre a Rnase, pero debemos prestar atención a que o DEPC é un carcinóxeno coñecido, polo que debe prestarse especial atención ao usalo.

Para a RNase, debemos partir de dous aspectos,o primeiro é inhibir a actividade da RNase endóxena

Os reactivos convencionais de extracción de ARN como o isotiocianato de guanidina e o DTT contidos en Trizol poden abrir o enlace disulfuro da RNase, pero aínda hai algunhas RNases, especialmente nas mostras de tecidos, así que preste atención ás baixas temperaturas.

1.Inmersa inmediatamente a mostra de tecido en nitróxeno líquido despois de sacala ou nunha solución comercial de conservación de ARN.

2.Despois de extraer o ARN da mostra celular, engádeo á solución de lise e lise na caixa de xeo.

3. É mellor usar nitróxeno líquido para moer cando as mostras de tecidos están homoxeneizadas.Cando use un homoxeneizador eléctrico sen nitróxeno líquido, preste atención ao arrefriamento completo do adaptador de homoxeneado.

A segunda é a DNase esóxena

1.Estar completamente armado, usar bata de laboratorio, usar unha máscara e asegurarse de levar un par de luvas novas (non sexas tan aforrativo! Hai que ter en conta que o Trizol é súper corrosivo, e tamén é moi forte a través das luvas, así que non che goteen as mans).

2.Todas as puntas de pipeta, tubos EP, tubos de PCR e outros equipos usados ​​deben ser tratados con de-RNase.Pódese empapar en DEPC ao 0,1% e despois presurizar a alta presión.Preste atención ao funcionamento nunha campana extractora.Os tiranos locais poden comprar directamente consumibles para eliminar encimas.

PD: Déixame dicirche un método preguiceiro.Aínda que a alta temperatura e a alta presión non poden eliminar completamente a RNase, eliminará unha gran parte dela.2 veces de alta temperatura e alta presión ten un bo efecto, e a extracción de ARN ten pouco efecto.

3.O alcohol pode desnaturalizar as proteínas,polo que a mesa de extracción de ARN pódese limpar con alcohol ao 75%. , e as luvas tamén se poden pulverizar con alcohol.

4.A solución final de disolución de ARN e o tubo de centrífuga tamén deben ser tratados con de-RNase.A auga DEPC é unha solución de disolución de ARN de uso común.Imos falar sobre o método correcto de preparación da auga DEPC (lembra volver empaquetar o DEPC comercial cando o compre)

Engade DEPC a auga ultrapura a 1:1000, axita ben, deixa repousar durante a noite a 37 °C e esteriliza a 121 °C a alta temperatura e alta presión durante 15 minutos.A auga DEPC pódese almacenar a -20 °C en alícuotas de 1 ml.

Finalmente, para resumir: a baixa temperatura é a clave, os consumibles manéxanse ben, están completamente armados e se fala menos!

Ben, iso é todo para a estratexia de hoxe.Deséxoche toda a concentración e pureza de ARN que mencionaches.Ambos os A260 e A280 son 2.0!!!

Por suposto, se usas aKit de extracción de ARN de operación a temperatura ambiente, é posible que non atopes os problemas anteriores.

O funcionamento a temperatura ambiente, sen engadir DNase, extrae o ARN total das células en 11 minutos e o ARN total de tecidos animais ou plantas en 30 minutos.

Para mostras de proba, póñase en contacto con:overseas@foregene.com

Produtos relacionados:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/