As transcriptasas inversas tradicionais non poden tolerar altas temperaturas (a temperatura óptima para a actividade do MMLV é de 37-50 °C e AMV de 42-60 °C).O ARN viral máis complexo non pode ser transcrito de forma inversa a cDNA a baixas temperaturas, o que resulta nunha eficiencia de detección A redución.A RT-qPCR tradicional require xeralmente a participación de dous encimas clave (transcriptase inversa e ADN polimerase), o que fai imposible simplificar o funcionamento do sistema de reacción e reducir o custo.Aquí presentaremos dúas transcriptases inversas resistentes a altas temperaturas, TtH e RevTaq.Estes dous encimas tamén teñen a función de ADN polimerase, polo que se denominan encimas bifuncionais.

ADN polimerase TtH

Debes ter oído falar de TtH, que se deriva da bacteria termófila Thermus thermophilus HB8.En presenza de catións divalentes como Mg2+, ten actividade de ADN polimerase.É moi utilizado en reaccións de PCR como o encima Taq, pero ten unha maior resistencia á calor que o encima Taq, polo que tamén ten un mellor efecto na PCR con modelos de alto contido en GC.

· Este encima basicamente non ten actividade exonuclease 3′→5′ e actividade exonuclease 5′→3′, polo que tamén se pode usar para a secuenciación de didesoxi.

· Este encima ten actividade RTase.En presenza de Mn2+, mellorarase a actividade da RTase.Usando esta función, pódese usar para realizar a reacción de transcrición inversa e a reacción de PCR no mesmo tubo, é dicir, RT-PCR nun paso.Non obstante, en presenza de Mn2+, a precisión da RT-PCR non é alta.A actividade RT non ten nada que ver coa actividade da rnaase H.

· O aumento da actividade da Tth-ADN polimerase (pH9, óptimo +55℃～+70℃, máximo +95℃) supera os problemas causados ​​pola estrutura secundaria do ARN.O ADNc resultante pódese amplificar mediante PCR co mesmo encima en presenza de ións Mg2+.

· A capacidade da Tth-ADN polimerase para realizar a transcrición inversa e a amplificación do ADN a altas temperaturas fai que este encima sexa útil para a RT-PCR cuantitativa, a clonación e a análise da expresión xénica do ARN celular e viral.
· A ADN-polimerase Tth úsase para a RT-PCR para amplificar o ARN ata 1 kb.

Características e vantaxes

ADN polimerase Tth:

• Garantir o tamaño optimizado do produto da reacción en cadea da polimerase (PCR), polo menos 1000 pb na reacción RT-PCR

• Aceptar como substrato o desoxirribonucleósido trifosfato modificado

• Non está relacionado coa actividade da RNase H

• Ten alta estabilidade térmica para superar problemas, normalmente relacionados coa alta estrutura secundaria presente no ARN

RevTaq RT-PCR ADN polimerase

Unha ADN polimerase resistente á calor con actividade de transcriptase inversa

A RevTaq-RT-PCR-DNA polimerase é un encima de dobre función, altamente resistente á calor, con actividades de transcriptase inversa e ADN polimerase obtidas mediante evolución dirixida e artificial.

· A vida media da ADN polimerase RevTaq RT-PCR a 95 °C é superior a 40 minutos.

· A ADN polimerase RevTaq RT-PCR permite a transcrición inversa a alta temperatura directamente desde o molde de ARN, e o paso de transcrición inversa pódese repetir varias veces para xerar máis modelos de ADNc.

· RevTaq RT-PCR ADN polimerase permite a RT-PCR en “paso cero” (sen paso de transcrición inversa isotérmica), porque na etapa de extensión da PCR cíclica, a transcrición inversa e a amplificación do ADN ocorren simultáneamente.Isto tamén promove a reacción de transcrición inversa a altas temperaturas, minimizando así os problemas que se atopan na fusión da forte estrutura secundaria do ARN a altas temperaturas.

· Debido á fórmula de arranque en quente baseada en aptámeros, a ADN polimerase RevTaq RT-PCR producirá mellores resultados cando a temperatura de recocido e extensión sexa superior a 57 °C.

· Dado que o encima é resistente á calor, recoméndase deseñar cebadores e sondas con puntos de fusión moi elevados (>60°C).

· Recoméndase optimizar a temperatura do paso de recocido/extensión a través dun gradiente de temperatura durante o proceso de configuración da reacción.

· A maior temperatura, maior especificidade da PCR.O ciclo de transcrición inversa adoita realizarse a unha temperatura máis alta que o ciclo de PCR, porque a hibridación ADN Primer:RNA Template adoita ter un punto de fusión máis alto que o duplex DNA Primer:cDNA Template.

· A ADN polimerase RevTaq RT-PCR está modificada xeneticamente e optimizada, e o tamaño do amplicón está entre 60-300 pb.

O límite de detección de ADN polimerase RevTaq RT-PCR alcanza as 4 copias/

Na figura móstrase o sistema de reacción optimizado (o establecemento de cebadores de alto punto de fusión).A RT-PCR impulsada por ADN polimerase de RevTaq RT-PCR mostra unha mellor sensibilidade que a mestura mestra de RT-qPCR de 1 paso TaqPath e un gradiente de dilución da mostra de detección máis baixo.

Máis vantaxes:

Función de inicio rápido → O paso inicial de desnaturalización térmica pódese omitir.

Fórmula de aptámero de arranque en quente → Proporciona inmediatamente unha actividade enzimática do 100 % e evita a amplificación inespecífica a baixas temperaturas (<57 °C).

Función de escisión → O paso de extracción de ARN omítese, porque a ADN polimerase RevTaq RT-PCR tamén pode procesar mostras de reacción brutas.Pode destruír inmediatamente as membranas celulares de eucariotas, bacterias e virus nun ciclo de RT-PCR quente.

Nivel de materia prima IVD → altos estándares de calidade e prezos extremadamente competitivos