一、Aumentar a sensibilidade do sistema de reacción:

1. Illar ARN de alta calidade:

A síntese exitosa de ADNc provén de ARN de alta calidade.O ARN de alta calidade debe ser polo menos de lonxitude total e libre de inhibidores da transcriptase inversa como EDTA ou SDS.A calidade do ARN determina a cantidade máxima de información de secuencia que podes transcribir ao ADNc.Un método común de purificación de ARN é un método dun paso que utiliza isotiocianato de guanidina/fenol ácido.Para evitar a contaminación por trazas de RNase, o ARN illado de mostras ricas en RNase (como o páncreas) debe almacenarse en formaldehido para preservar o ARN de alta calidade, especialmente para o seu almacenamento a longo prazo.O ARN extraído do fígado de rata degradouse basicamente despois de ser almacenado en auga durante unha semana, mentres que o ARN extraído do bazo de rata permaneceu estable despois de ser almacenado en auga durante 3 anos.Ademais, as transcricións de máis de 4 kb son máis sensibles á degradación por trazas de RNase que as pequenas transcricións.Para aumentar a estabilidade das mostras de ARN almacenadas, o ARN pódese disolver en formamida desionizada e almacenarse a -70 °C.A formamida utilizada para preservar o ARN debe estar libre de restos que degradan o ARN.O ARN do páncreas pódese conservar en formamida durante polo menos un ano.Cando se prepare para usar ARN, pode usar o seguinte método para precipitar o ARN: engadir NaCl a 0,2 M e 4 veces o volume de etanol, colocar a temperatura ambiente durante 3-5 minutos e centrifugar a 10.000×g durante 5 minutos.

2. Use a transcriptase inversa RNaseH inactiva (RNaseH-):

Os inhibidores da RNase adoitan engadirse ás reaccións de transcrición inversa para aumentar a lonxitude e o rendemento da síntese de ADNc.Os inhibidores da RNase deben engadirse durante a reacción de síntese da primeira febra en presenza dun tampón e un axente redutor (como DTT), porque o proceso previo á síntese de ADNc desnaturaliza o inhibidor, liberando así a RNase unida que pode degradar o ARN.Os inhibidores da proteína RNase só evitan a degradación do ARN pola RNase A, B, C e non impiden a RNase na pel, polo que teña coidado de non introducir RNase polos dedos a pesar do uso destes inhibidores.

A transcriptase inversa cataliza a conversión de ARN en ADNc.Tanto o M-MLV como o AMV teñen actividade RNaseH endóxena ademais da súa propia actividade polimerase.A actividade da RNaseH e a actividade da polimerase compiten entre si pola cadea híbrida formada entre o molde de ARN e o cebador de ADN ou a cadea de extensión de ADNc, e degradan a cadea de ARN no complexo ARN:ADN.O molde de ARN degradado pola actividade da RNaseH xa non pode servir como substrato eficaz para a síntese de ADNc, o que reduce o rendemento e a duración da síntese de ADNc.Polo tanto, sería beneficioso eliminar ou reducir moito a actividade da RNaseH da transcriptase inversa.。

A transcriptase inversa SuperScript Ⅱ, a transcriptase inversa RNaseH-MMLV e a transcriptase inversa thermoScript, RNaseH-AMV, poden obter máis cantidade e máis ADNc de lonxitude que MMLV e AMV.A sensibilidade da RT-PCR verase afectada pola cantidade de síntese de ADNc.ThermoScript é moito máis sensible que AMV.O tamaño dos produtos de RT-PCR está limitado pola capacidade da transcriptase inversa para sintetizar ADNc, especialmente cando se clonan ADNc máis grandes.En comparación co MMLV, SuperScripⅡ aumentou significativamente o rendemento dos produtos longos de RT-PCR.A RNaseH-transcritase inversa tamén ten maior termoestabilidade, polo que a reacción pódese realizar a temperaturas superiores ás normais de 37-42 °C.Baixo as condicións de síntese suxeridas, use o cebador oligo(dT) e 10 μCi de [α-P]dCTP.O rendemento total da primeira cadea calculouse mediante o método de precipitación TCA.Analizouse o ADNc de lonxitude completa usando bandas clasificadas por tamaños escindidas e contadas nun xel de agarosa alcalina.

3. Elevar a temperatura de incubación para a transcrición inversa:

Unha temperatura de incubación máis alta axuda a abrir a estrutura secundaria do ARN, aumentando o rendemento da reacción.Para a maioría dos modelos de ARN, a incubación do ARN e dos cebadores a 65 °C sen tampón ou sal, seguido dun arrefriamento rápido en xeo, eliminará a maioría das estruturas secundarias e permitirá que os cebadores se unan.Non obstante, algúns modelos aínda teñen estruturas secundarias, mesmo despois da desnaturalización térmica.A amplificación destes modelos difíciles pódese realizar mediante a transcriptase inversa ThermoScript e colocando a reacción de transcrición inversa a unha temperatura máis alta para mellorar a amplificación.As temperaturas de incubación máis altas tamén poden aumentar a especificidade, especialmente cando se usan cebadores específicos de xenes (GSP) para a síntese de cDNA (ver capítulo 3).Se utiliza GSP, asegúrese de que a Tm dos cebadores é a mesma que a temperatura de incubación esperada.Non use cebadores oligo(dT) e aleatorios por riba de 60 °C.Os cebadores aleatorios requiren incubación a 25 °C durante 10 minutos antes de aumentar a 60 °C.Ademais de utilizar unha temperatura de transcrición inversa máis alta, tamén se pode mellorar a especificidade transferindo directamente a mestura de ARN/cebador desde a temperatura de desnaturalización de 65 °C á temperatura de incubación de transcrición inversa e engadindo unha mestura de reacción 2x ​​prequentada (síntese de inicio en quente de ADNc).Este enfoque axuda a evitar o emparellamento de bases intermoleculares que se produce a temperaturas máis baixas.O cambio de temperatura múltiple necesario para a RT-PCR pódese simplificar usando un termociclador.

A polimerase termoestable Tth actúa como ADN polimerase en presenza de Mg2+ e como ARN polimerase en presenza de Mn2+.Pódese manter quente a unha temperatura máxima de 65 °C.Non obstante, a presenza de Mn2+ durante a PCR reduce a fidelidade, o que fai que a polimerase Tth sexa menos apta para a amplificación de alta precisión, como a clonación de ADNc.Ademais, o Tth ten unha eficiencia de transcrición inversa baixa, o que reduce a sensibilidade e, dado que a transcrición inversa e a PCR poden realizarse cun único encima, as reaccións de control sen transcrición inversa non se poden utilizar para comparar produtos de amplificación de ADNc con ADN xenómico contaminante.Separáronse os produtos de amplificación.

4. Aditivos que promoven a transcrición inversa:

Engádense aditivos que inclúen glicerol e DMSO á reacción de síntese da primeira cadea, o que pode reducir a estabilidade da dobre cadea do ácido nucleico e desatar a estrutura secundaria do ARN.Pódese engadir ata un 20% de glicerol ou un 10% de DMSO sen afectar a actividade de SuperScript II ou MMLV.O AMV tamén pode tolerar ata un 20% de glicerol sen perda de actividade.Para maximizar a sensibilidade da RT-PCR na reacción de transcrición inversa SuperScriptⅡ, pódese engadir glicerol ao 10% e incubarse a 45 °C.Se se engade 1/10 do produto da reacción de transcrición inversa á PCR, entón a concentración de glicerol na reacción de amplificación é do 0,4%, o que non é suficiente para inhibir a PCR.

5. Tratamento RNaseH:

O tratamento das reaccións de síntese de ADNc con RNaseH antes da PCR pode aumentar a sensibilidade.Para algúns modelos, pénsase que o ARN na reacción de síntese de ADNc impide a unión dos produtos de amplificación, nese caso o tratamento con RNaseH pode aumentar a sensibilidade.Xeralmente, o tratamento con RNaseH é necesario cando se amplifican modelos diana de ADNc de lonxitude completa máis longos, como a esquerose tuberosa II de baixa copia.Para este modelo difícil, o tratamento con RNaseH mellorou o sinal producido por SuperScript II ou o ADNc sintetizado por AMV.Para a maioría das reaccións de RT-PCR, o tratamento con RNaseH é opcional, porque a etapa de desnaturalización da PCR a 95 °C xeralmente hidroliza o ARN no complexo ARN:ADN.

6. Mellora do método de detección de ARN pequeno:

A RT-PCR é especialmente difícil cando só se dispón de pequenas cantidades de ARN.O glicóxeno engadido como vehículo durante o illamento de ARN axuda a aumentar o rendemento de pequenas mostras.Pódese engadir glicóxeno sen RNase ao mesmo tempo que engadir Trizol.O glicóxeno é soluble en auga e pódese manter na fase acuosa con ARN para axudar a precipitación posterior.Para mostras de menos de 50 mg de tecido ou 106 células cultivadas, a concentración recomendada de glicóxeno libre de RNase é de 250 μg/ml.

Engadir BSA acetilado á reacción de transcrición inversa usando SuperScript II pode aumentar a sensibilidade, e para pequenas cantidades de ARN, reducir a cantidade de SuperScript II e engadir 40 unidades de inhibidor de nuclease RNaseOut pode aumentar o nivel de detección.Se se usa glicóxeno no proceso de illamento do ARN, recoméndase engadir un inhibidor de BSA ou RNase cando se use SuperScript II para a reacción de transcrición inversa.

二、Aumenta a especificidade da RT-PCR

1. Síntese CND:

A síntese de ADNc da primeira cadea pódese iniciar mediante tres métodos diferentes, cuxa especificidade relativa afecta á cantidade e tipo de ADNc sintetizado.

O método de cebamento aleatorio foi o menos específico dos tres métodos.Os cebadores recocidon en múltiples sitios ao longo do transcrito, xerando ADNc curtos e de lonxitude parcial.Este método utilízase con frecuencia para obter secuencias finais 5′ e para obter ADNc de moldes de ARN con rexións de estrutura secundaria ou con sitios de terminación que non se poden replicar pola transcriptase inversa.Para obter o ADNc máis longo, a relación entre cebadores e ARN en cada mostra de ARN debe determinarse empíricamente.A concentración inicial de cebadores aleatorios variou de 50 a 250 ng por 20 μl de reacción.Dado que o ADNc sintetizado a partir de ARN total usando cebadores aleatorios é principalmente ARN ribosómico, polo xeral escóllese poli(A)+ARN como molde.

Os cebadores oligo(dT) son máis específicos que os cebadores aleatorios.Hibridízase coa cola poli(A) que se atopa no extremo 3′ da maioría dos ARNm eucariotas.Como o ARN poli(A)+ é aproximadamente do 1% ao 2% do ARN total, a cantidade e complexidade do ADNc é moito menor que con cebadores aleatorios.Debido á súa alta especificidade, o oligo(dT) xeralmente non require optimización da proporción de ARN a cebadores e selección de poli(A)+.Recoméndase usar 0,5 μg de oligo(dT) por 20 μl de sistema de reacción.oligo(dT)12-18 é axeitado para a maioría da RT-PCR.O sistema ThermoScript RT-PCR ofrece oligo(dT)20 debido á súa mellor estabilidade térmica para temperaturas de incubación máis altas.

Os cebadores específicos de xenes (GSP) son os cebadores máis específicos para a etapa de transcrición inversa.O GSP é un oligonucleótido antisentido que pode hibridarse especificamente coa secuencia diana do ARN, a diferenza dos cebadores aleatorios ou o oligo(dT), que se hibridan con todos os ARN.As mesmas regras utilizadas para deseñar cebadores de PCR aplícanse ao deseño de GSP nas reaccións de transcrición inversa.O GSP pode ser a mesma secuencia que o cebador de amplificación que se hibrida ata o extremo 3′ máis do ARNm, ou o GSP pode ser deseñado para hibridar augas abaixo do cebador de amplificación inversa.Para algúns suxeitos amplificados, hai que deseñar máis dun cebador antisentido para unha RT-PCR exitosa porque a estrutura secundaria do ARN diana pode impedir a unión do cebador.Recoméndase usar 1 pmol de GSP antisentido nunha reacción de síntese de primeira cadea de 20 μl.

2. Elevar a temperatura de incubación para a transcrición inversa:

Para aproveitar o máximo proveito da especificidade do GSP, debe utilizarse unha transcriptase inversa con maior termoestabilidade.As transcriptases inversas termoestables pódense incubar a temperaturas máis altas para aumentar a rigorosidade da reacción.Por exemplo, se un GSP se recoce a 55 °C, a especificidade do GSP non se utilizará plenamente se se usa AMV ou M-MLV para a transcrición inversa a unha baixa rigurosidade de 37 °C.Non obstante, SuperScript II e ThermoScript poden reaccionar a 50 °C ou máis, o que eliminará os produtos non específicos xerados a temperaturas máis baixas.Para a máxima especificidade, a mestura de ARN/cebador pódese transferir directamente desde a temperatura de desnaturalización de 65 °C á temperatura de incubación de transcrición inversa e engadirse a unha mestura de reacción 2x ​​prequentada (inicio en quente de síntese de ADNc).Isto axuda a evitar o emparellamento de bases intermoleculares a baixas temperaturas.As múltiples transicións de temperatura necesarias para a RT-PCR pódense simplificar usando un termociclador.

3. Reduce a contaminación do ADN xenómico:

Unha dificultade potencial que se atopa coa RT-PCR é a contaminación do ADN xenómico no ARN.Usar un bo método de illamento de ARN, como o reactivo Trizol, reducirá a cantidade de ADN xenómico que contamina a preparación de ARN.Para evitar produtos derivados do ADN xenómico, o ARN pódese tratar con DNase I de grao de amplificación para eliminar o ADN contaminante antes da transcrición inversa.A dixestión da DNase I terminouse incubando as mostras en EDTA 2,0 mM durante 10 minutos a 65 °C.O EDTA pode quelar os ións magnesio, evitando a hidrólise do ARN dependente do ión magnesio a altas temperaturas.

Co fin de separar o ADNc amplificado dos produtos contaminantes de amplificación de ADN xenómico, pódense deseñar cebadores que se asocien para separar exóns.Os produtos de PCR derivados do ADNc serán máis curtos que os derivados do ADN xenómico contaminado.Ademais, realizouse un experimento de control sen transcrición inversa en cada molde de ARN para determinar se un determinado fragmento derivaba do ADN xenómico ou do ADNc.O produto da PCR obtido sen transcrición inversa deriva do xenoma.