Todo o mundo está a falar do principio do experimento qRT-PCR, o deseño de cebadores, a interpretación dos resultados, etc., pero creo que debería compartir con vostede a operación experimental de qRT-PCR.É pequeno, pero trátase de resultados.

Antes de facer qRT-PCR, necesitamos ter unha comprensión clara do noso propio ARN e métodos de operación.Despois de todo, os nosos esforzos están dirixidos a obter resultados, en lugar de simplemente practicar.Polo tanto, antes de facer qRT-PCR, necesitamos determinar os seguintes problemas (algúns dos cales só son aplicables a SYBR).

1 Estás seguro de que o teu ARN non está degradado?

NanoDrop 2000 só pode detectar a concentración e pureza do ARN, pero non pode detectar a integridade do ARN.

O valor de ARN (ARN Intesity Number) pode reflectir a integridade do ARN, que é detectada polo sistema Agilent 2100 Bioanalyzer.

Fig. Diagrama esquemático dos valores de RIN para diferentes mostras de ARN (eucariotas)

Non obstante, os laboratorios xeralmente non teñen o Agilent 2100 Bioanalyzer.Neste caso, podemos detectar a través do xel de formaldehido, pero o requisito para a cantidade total de ARN é alto, polo que o método máis rápido é utilizar a electroforese en xel ordinaria.Requírese estar nun ambiente libre de nucleasas, polo que é necesario lavar o tanque de electroforese, a botella de sol, o soporte de xel e peitear con auga DEPC.A agarosa tamén está libre de nuclease (sempre que estea recén aberta), e o Loading Buffer debe abrirse o máximo posible, cun xel ao 1,2%.

Teña en conta que o xel debe estar completamente disolto, se non, provocará bandas non homoxéneas, como se mostra na mostra 9 da figura.Se a tensión é demasiado alta ou funciona durante demasiado tempo xerará calor e provocará a degradación do ARN, polo que a tensión e o tempo deben controlarse razoablemente.Ademais, a execución do xel tamén pode determinar aínda máis se hai residuos de ADN na mostra e observar se hai un gran número de bandas retidas no pozo de distribución.

Figura.Detección de ARN mediante electroforese en xel

2 Estás seguro da concentración do teu cDNA?

A experiencia dos irmáns maiores no laboratorio é que o ADNc do sistema de 20 ul obtido por cada inversión dilúese directamente 20X, mentres que as irmás posdoutorais dilúense 10X.Normalmente dependo da situación.Debido a que a calidade do ARN mencionado por cada persoa é diferente, o nivel de reversión tamén é diferente e a tecnoloxía de reversión pode non ser estable.

Entón, cada vez que reciba o ADNc invertido, primeiro diluireino unhas 3 veces, e despois usarei o xene doméstico para facer a RT-PCR, o número de ciclos é xeralmente de 25 ciclos, para identificar a concentración específica e, a continuación, determinar o factor de dilución final.

3 Estás seguro de que as túas imprimacións son fáciles de usar?

Pode pasar a curva de fusión da qRT-PCR, pero isto aínda custa cartos.Para os laboratorios sen moito diñeiro, cando obteñen moitos cebadores, poden usar RT-PCR ordinaria para ver se é unha soa banda e identificar a especificidade dos cebadores.Se o laboratorio non ten diñeiro, a especificidade de todos os cebadores pódese identificar unha vez a través da curva de fusión.

4 Estás seguro de que as túas condicións experimentais son adecuadas?

SYBR debe estar protexido da luz forte, polo que intenta apagar a luz superior ao engadir o reactivo SYBR e só necesitas usar unha luz tenue para completalo.

Almacenar SYBR a 4 °C.Cando estea en uso, inverte suavemente cara arriba e abaixo para mesturar ben para evitar a formación de escuma, e non vórtices vigorosamente.

Algunhas irmás máis novas gústalles debuxar marcas no taboleiro de PCR por medo a mesturar as mostras, o que está mal.Debido a que é moi probable que os teus marcadores afecten a recollida de sinais fluorescentes, recoméndolles xeralmente aos mozos que usen cadernos experimentais para axudar na memoria, como se mostra a continuación.

Figura.Diagrama de carga de mostra de qRT-PCR

5 Estás seguro de que o estás facendo ben?

Asegúrate de usar luvas, usar luvas, usar luvas e dicir cousas importantes tres veces.

Para reducir a exposición de SYBR á luz, personalmente gústame engadir primeiro un modelo, como se mostra na figura a continuación.Segundo a experiencia, é probable que a adición dunha pequena cantidade de modelo cause erros de mostraxe.Polo tanto, para minimizar o erro causado ao engadir unha pequena cantidade de modelo, adoito duplicar a mostra de novo e duplicar a cantidade ao engadir a mostra para reducir a cantidade de H2O2 engadido.

Figura.Diagrama esquemático da carga de qRT-PCR

A continuación, configure o sistema qRT-PCR do seguinte xeito.

Figura.Diagrama de preparación do sistema qRT-PCR

NOTA: O proceso de configuración debe facerse en xeo.

Despois de engadir a mostra, pegue a película de selado transparente.Probe a non tocar a superficie da película de selado transparente coas mans, só opera desde o espazo a ambos os dous lados da película.Porque as impresións dixitais tamén poden afectar a recollida de sinais fluorescentes.A continuación, use unha centrífuga para centrifugar rapidamente durante 10 s a baixa velocidade para evitar que a mostra colgue da parede.

Produtos relacionados:

Kit Cell Direct RT-qPCR

RT Easy II