A PCR (reacción en cadea da polimerase) é unha das tecnoloxías de amplificación de ADN in vitro, cunha historia de máis de 30 anos.

A tecnoloxía PCR foi iniciada por Kary Mullis de Cetus, EUA en 1983. Mullis solicitou unha patente de PCR en 1985 e publicou o primeiro traballo académico de PCR sobre Science no mesmo ano.Mullis foi galardoado co Premio Nobel de Química en 1993 polo seu traballo.

Principios básicos da PCR

A PCR pode amplificar fragmentos de ADN obxectivo máis dun millón de veces.O principio está baixo a catálise da ADN polimerase, utilizando o ADN da cadea parental como molde e o cebador específico como punto de partida para a extensión.Replícase in vitro mediante etapas como a desnaturalización, o recocido e a extensión.O proceso do ADN da cadea filla complementario ao ADN molde da cadea nai.

O proceso estándar de PCR divídese en tres pasos:

1.Desnaturalización: use alta temperatura para separar as dobres cadeas de ADN.O enlace de hidróxeno entre as dobres cadeas de ADN rómpese a altas temperaturas (93-98 ℃).

2.Recocido: despois de que se separe o ADN de dobre cadea, baixa a temperatura para que o cebador poida unirse ao ADN monocatenario.

3.Extensión: a ADN polimerase comeza a sintetizar cadeas complementarias ao longo das cadeas de ADN a partir dos cebadores unidos cando baixa a temperatura.Cando se completa a extensión, complétase un ciclo e o número de fragmentos de ADN duplícase

Ao alternar estes tres pasos 25-35 veces, o número de fragmentos de ADN aumentará exponencialmente.

O enxeño da PCR é que se poden deseñar diferentes cebadores para diferentes xenes diana, de xeito que os fragmentos de xenes diana poden amplificarse nun curto período de tempo.

Ata agora, a PCR pódese dividir en tres categorías, a saber, PCR ordinaria, PCR cuantitativa fluorescente e PCR dixital.

A primeira xeración de PCR ordinaria

Use un instrumento de amplificación PCR común para amplificar o xene diana e, a continuación, use electroforese en xel de agarosa para detectar o produto, só se pode facer análise cualitativa.

As principais desvantaxes da PCR de primeira xeración:

1.Propenso á amplificación inespecífica e resultados falsos positivos.

2.A detección leva moito tempo e a operación é complicada.

3.Só se pode facer unha proba cualitativa

PCR en tempo real de segunda xeración

A PCR en tempo real, tamén coñecida como qPCR, utiliza sondas fluorescentes que poden indicar o progreso do sistema de reacción, supervisa a acumulación de produtos amplificados mediante a acumulación de sinais fluorescentes e xulga os resultados a través da curva de fluorescencia.Pódese cuantificar coa axuda do valor Cq e da curva estándar.

Dado que a tecnoloxía qPCR lévase a cabo nun sistema pechado, a probabilidade de contaminación redúcese e o sinal de fluorescencia pódese controlar para a detección cuantitativa, polo que é a máis utilizada na práctica clínica e converteuse na tecnoloxía dominante na PCR.

As substancias fluorescentes utilizadas na PCR cuantitativa fluorescente en tempo real pódense dividir en: sonda fluorescente TaqMan, balizas moleculares e colorante fluorescente.

1)Sonda fluorescente TaqMan:

Durante a amplificación por PCR, engádese unha sonda fluorescente específica mentres se engade un par de cebadores.A sonda é un oligonucleótido, e os dous extremos están marcados cun grupo fluorescente indicador e un grupo fluorescente extintor.

Cando a sonda está intacta, o sinal fluorescente emitido polo grupo informador é absorbido polo grupo de extinción;durante a amplificación da PCR, a actividade exonuclease 5′-3′ do encima Taq escinde e degrada a sonda, facendo que o grupo fluorescente informador e o extinguidor sepárase o grupo fluorescente, de xeito que o sistema de monitorización da fluorescencia pode recibir o sinal de fluorescencia, é dicir, cada vez que se amplifica unha cadea de ADN, o sinal de fluorescencia acumúlase completamente e acumúlase a formación de fluorescencia. o produto PCR.

2) Colorante fluorescente SYBR:

No sistema de reacción PCR, engádese un exceso de colorante fluorescente SYBR.Despois de que o colorante fluorescente SYBR se incorpore de forma non específica á dobre cadea de ADN, emite un sinal fluorescente.A molécula de colorante SYBR que non está incorporada á cadea non emitirá ningún sinal fluorescente, garantindo así o sinal fluorescente. O aumento dos produtos da PCR está completamente sincronizado co aumento dos produtos da PCR.SYBR só se une ao ADN de dobre cadea, polo que a curva de fusión pódese usar para determinar se a reacción de PCR é específica.

3) Baliza molecular:

É unha sonda de oligonucleótido dobre marcado con bucle de talo que forma unha estrutura de forquilla dunhas 8 bases nos extremos 5 e 3.As secuencias de ácidos nucleicos en ambos os extremos están emparelladas complementariamente, o que fai que o grupo fluorescente e o grupo de extinción estean axustados.Pecha, non se producirá fluorescencia.

Despois de xerar o produto da PCR, durante o proceso de recocido, a parte media da baliza molecular emparellase cunha secuencia de ADN específica e o xene fluorescente sepárase do xene quencher para producir fluorescencia.

As principais desvantaxes da PCR de segunda xeración:

Aínda falta sensibilidade e a detección de exemplares de pouca copia é imprecisa.

Hai a influencia do valor de fondo e o resultado é susceptible de interferencias.

Cando hai inhibidores da PCR no sistema de reacción, os resultados da detección son susceptibles de interferencia.

PCR dixital de terceira xeración

A PCR dixital (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calcula o número de copia da secuencia de destino mediante a detección do punto final e pode realizar unha detección cuantitativa absoluta precisa sen utilizar controis internos e curvas estándar.

A PCR dixital utiliza a detección do punto final e non depende do valor Ct (limiar do ciclo), polo que a reacción da PCR dixital vese menos afectada pola eficiencia da amplificación e mellórase a tolerancia aos inhibidores da reacción de PCR, cunha alta precisión e reproducibilidade.

Debido ás características de alta sensibilidade e alta precisión, non é facilmente interferido polos inhibidores da reacción de PCR, e pode lograr unha verdadeira cuantificación absoluta sen produtos estándar, que se converteu nun punto de investigación e aplicación.

Segundo as diferentes formas da unidade de reacción, pódese dividir en tres tipos principais: sistemas microfluídicos, chip e gotas.

1) PCR dixital microfluídica, mdPCR:

Baseándose na tecnoloxía microfluídica, sepárase o molde de ADN.A tecnoloxía microfluídica pode realizar a nano-actualización da mostra ou a xeración de gotículas máis pequenas, pero as gotículas necesitan un método de adsorción especial e logo combinadas co sistema de reacción PCR.mdPCR foi adoptado gradualmente por outros métodos substituír.

2) PCR dixital baseada en gotas, ddPCR:

Use a tecnoloxía de xeración de gotas de auga en aceite para procesar a mostra en gotículas e divida o sistema de reacción que contén moléculas de ácido nucleico en miles de gotas a nanoescala, cada unha das cales non contén a molécula diana de ácido nucleico que se vai detectar, ou Contén unha ou varias moléculas de ácido nucleico que se van probar.

3) PCR dixital baseada en chip, cdPCR:

Use a tecnoloxía integrada da vía de fluídos para gravar moitos microtubos e microcavidades en obleas de silicio ou vidro de cuarzo, e controlar o fluxo da solución a través de diferentes válvulas de control, e dividir o líquido da mostra en nanómetros do mesmo tamaño nos pozos de reacción para a reacción de PCR dixital para acadar a cuantificación absoluta.

As principais desvantaxes da PCR de terceira xeración:

O equipo e os reactivos son caros.

Os requisitos de calidade do modelo son altos.Se a cantidade do modelo supera a cantidade do microsistema, será imposible cuantificar, e se é demasiado pequena, a precisión da cuantificación reducirase.

Tamén se poden xerar falsos positivos cando hai amplificación inespecífica.