PCR, múltiple PCR, PCR in situ, PCR inversa, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Ordenaremos os conceptos, pasos e detalles de varias PCR

Ⅰ. PCR

A reacción en cadea da polimerase, coñecida como PCR, é unha tecnoloxía biolóxica molecular que se usa para ampliar fragmentos específicos de ADN.Pódese considerar como unha replicación especial do ADN in vitro.A ADN polimerase (ADN polimerase I) foi descuberta xa en 1955, e o Fragmento de Klenow de E. Coli, que ten valor experimental e practicidade, foi descuberto polo doutor H. Klenow a principios dos anos 70, pero debido a que este encima non tolera a temperatura, a alta temperatura pode dexenerala, polo que non se atopa coa reacción de dexeneración da polimerase a alta temperatura.Os encimas que se usan na actualidade (chamados Taq polimerase), foron illados de Thermus aquaticus, unha bacteria de augas termais en 1976. A súa característica é que pode resistir as altas temperaturas e é un encima ideal, pero utilízase moito despois dos anos 80.O concepto orixinal do prototipo primitivo orixinal da PCR é semellante á reparación e copia de xenes, que foi proposto polo doutor KJell Kleppe en 1971. Publicou a primeira copia xenética simple e a curto prazo (semellante ás dúas primeiras reaccións de ciclo da PCR).O PCR desenvolvido hoxe foi desenvolvido polo doutor Kary B. Mullis en 1983. O doutor Mullis serviu empresas de PE ese ano, polo que PE ten un estatus especial na industria da PCR.O doutor Mullis publicou oficialmente o primeiro artigo relacionado con Saiki e outros en 1985. Desde entón, o uso da PCR é de miles de quilómetros ao día, e pódese dicir que a calidade dos artigos relacionados fai que moitos outros métodos de investigación sexan desagradables.Posteriormente, a tecnoloxía PCR úsase amplamente na investigación científica biolóxica e nas aplicacións clínicas, converténdose na tecnoloxía máis importante da investigación en bioloxía molecular.Mullis tamén gañou o Premio Nobel de Química en 1993.

PCRPrincipio

O principio básico da tecnoloxía da PCR é semellante ao proceso de replicación natural do ADN, e a súa especificidade depende do cebador oligonucleótido que é complementario a ambos os extremos da secuencia diana.A PCR componse de tres etapas de reaccións básicas de dexeneración-recocido: ①Dexeneración do ADN modelo: despois de que o ADN modelo se quenta a uns 93 °C durante un determinado período de tempo, a solución de ADN dobre para o ADN de cadea dual formada pola amplificación da PCR do ADN modelo Deixando, convérteo nunha única cadea para preparar a seguinte cadea de cebador para preparar a seguinte reacción.②O recocido (composto) do ADN modelo e do cebador: despois de que o ADN modelo se quenta e se dexenere nunha única cadea, a temperatura cae a uns 55 °C.A secuencia complementaria do cebador e do ADN modelo monocatenario.③A extensión do cebador: plantilla de ADN: a unión do cebador baséase na acción da TaqDNA polimerase, co dNTP como materia prima da reacción.Manter o principio de replicación, sintetizar unha nova cadea de copias semi-reservadas que complementan a cadea de ADN modelo e repetir ciclos de dexeneración-recocido-extensión tres procesos poden obter máis "cadea de copias semi-reservadas", e esta nova cadea está dispoñible de novo. Convértese nun modelo para o próximo ciclo.Tarda entre 2 e 4 minutos en completar o ciclo, o xene obxectivo pódese amplificar varios millóns de veces en 2-3 horas.

EstándarPCRSistema de reacción

Cinco elementos da reacción de PCR

Hai principalmente cinco tipos de substancias implicadas na reacción de PCR, a saber, cebador, encima, dNTP, molde e tampón (requírese Mg2+).[Procedemento de PCR]

O proceso estándar de PCR divídese en tres pasos

1. Dexeneración do ADN (90°C-96°C): plantillas de ADN de cadea dual baixo acción térmica, os enlaces de hidróxeno rompen, formando un ADN de cadea única.

2. Recocido (25 ℃ -65 ℃): a temperatura do sistema redúcese, o cebador combínase co molde de ADN para formar unha cadea dual local.

3. Extensión (70 ℃ -75 ℃): Baixo a acción do encima Taq (uns 72 °C, a mellor actividade), úsase dNTP como materia prima, esténdese desde o extremo 5′ do cebador → extremo 3′, a síntese e o molde complétanse entre si a cadea de ADN.

Cada ciclo é desnaturalizado, recocido e estendido, duplicando o contido de ADN.Na actualidade, debido á curta área de amplificación, algunha PCR pódese replicar en moi pouco tempo aínda que a actividade enzimática Taq non sexa óptima, polo que se pode cambiar a dous pasos, é dicir, o recocido e a extensión poden realizarse a 60 °C-65 °C ao mesmo tempo.Co fin de reducir o proceso de elevación e arrefriamento e mellorar a velocidade de resposta.

Características da reacción PCR

● Alta especificidade

Os factores decisivos específicos da resposta da PCR son: ①A combinación específica do cebador e do ADN molde.②O principio de emparellamento de bases.③A lealdade da reacción de síntese da polimerase TaqDNA.④A especificidade e conservatividade do xene diana.

A combinación correcta de imprimacións e modelos é a clave.A unión do cebador e do molde e a extensión da cadea do cebador baséanse no principio de correspondencia de bases alcalinas.A fidelidade das reaccións de síntese da polimerase e a resistencia á alta temperatura da ADN polimerase Taq para facer a unión (composto) do molde e do cebador na reacción pódese realizar a unha temperatura máis alta.A especificidade da combinación aumenta moito.O clip pode manter un alto grao de corrección.Ao seleccionar unha rexión xenética diana con alta conservatividade e alta conservatividade, a súa especificidade é maior.

● Alta Sensibilidade

O volume de produción de produtos de PCR increméntase mediante un índice, o que pode ampliar o modelo inicial de Picker (PG=10-12) para aumentar o nivel de microcontrolador ao nivel de microgramos (μg= -6).Unha célula diana pódese detectar a partir de 1 millón de células;na detección de virus, a sensibilidade da PCR pode chegar a 3 RFU (unidades formadas por puntos baleiros);a taxa de detección mínima na ciencia bacteriana é de 3 bacterias.

● Sinxelo e Rápido

A reflexión da PCR usa unha ADN polimerase Taq de alta temperatura, que engade a solución de reacción ao mesmo tempo, é dicir, unha reacción de dexeneración-recocido-extensión na solución de amplificación de ADN e na pota de baño de auga.Xeralmente, a reacción de amplificación complétase en 2 a 4 horas.Os produtos aumentados son xeralmente analizados por espada eléctrica e non teñen que usar isótopos, non hai contaminación radioactiva e fácil promoción.

● A pureza da mostra é baixa

Non hai necesidade de separar virus ou bacterias e cultivo de células.Os produtos brutos de ADN e ARN pódense utilizar como amplificadores.A detección de amplificación de ADN pódese usar directamente usando mostras clínicas como sangue, líquido corporal, líquido para lavar a tose, cabelo, células e tecido vivo.

PCRproblemas comúns

● Falso negativo, sen bandas amplificadas

As etapas clave da reacción de PCR inclúen: ① preparación de ácidos nucleicos molde, ② calidade e especificidade dos cebadores, ③ a calidade dos encimas ④ Condicións do ciclo de PCR.Tamén se debe analizar e estudar atopar o motivo para as ligazóns anteriores.

Modelos: ① O modelo contén proteínas varias, ② O modelo contén un inhibidor da encima Taq, ③ A proteína do molde non se elimina, especialmente a proteína do grupo do cromosoma.⑤ A dexeneración de ácidos nucleicos Deminer non é completa.Cando a calidade das encimas e dos cebadores é boa, non hai banda de amplificación, que é o máis probable o tratamento dixestivo dos exemplares.Hai algo mal no proceso de extracción de ácidos nucleicos do molde, polo que para preparar unha solución de dixestión eficaz e estable, o seu procedemento debe ser corrixido e non cambiado arbitrariamente.

Inactivación enzimática: debe utilizarse un encima novo ou ambos os anteriores e os novos encima para analizar se a actividade enzimática se perde ou é insuficiente, o que leva a falsos negativos.Nótese que a encima Taq ou o bromuro de etidio ás veces se esquece.

Cebador: a calidade do cebador, a concentración do cebador e se a concentración dos dous cebadores é simétrica.É unha razón común para o fracaso da PCR ou a banda crecente non é ideal e propensa a difundirse.Hai problemas coa calidade dos cebadores dalgúns números de lote.Os dous cebadores teñen unha concentración elevada e unha concentración baixa, o que provoca unha amplificación asimétrica de baixa eficiencia.As contramedidas son: ① Seleccione un bo cebador para sintetizar unidades.② A concentración do cebador non só depende do valor OD, senón que tamén presta atención ao líquido orixinal do cebador para facer electroforese en xel de azucre de agar.Debe haber unha zona de tiras de imprimación e o brillo dos dous imprimadores debe ser en xeral consistente.Belt, a PCR pode fallar neste momento e debería resolverse coa unidade de síntese de cebadores.Se unha imprimación é alta, o brillo é baixo e a súa concentración debe equilibrarse cando se dilúe.③ O imprimador debe pagarse e almacenarse nunha concentración elevada para evitar que se conxelen múltiples ou partes de refrixeración a longo prazo do frigorífico, o que fará que o imprimador se deteriore e se degrade.④ O deseño do cebador non é razoable, como a lonxitude do cebador é insuficiente e o di cluster está formado entre os cebadores.

Mg2 + concentración: a concentración de Mg2 + ión ten un gran impacto na eficiencia da amplificación da PCR.A concentración excesiva pode reducir o sexo oposto da amplificación por PCR.Se a concentración é demasiado baixa, a saída da amplificación da PCR incluso fará falla a amplificación da PCR sen a banda de expansión.

Cambio de volume de reacción: o volume utilizado na amplificación da PCR é de 20ul, 30ul e 50ul ou 100ul, o gran volume da aplicación para a amplificación da PCR establécese segundo os diferentes propósitos de investigación científica e probas clínicas.Despois de facer pequenos volumes como 20ul, é necesario facer unha condición de cordón ao facer o tamaño, se non, fallará.

Razóns físicas: a transformación é moi importante para a amplificación por PCR.Se a temperatura de dexeneración é baixa, o tempo de dexeneración é curto, é probable que se produza en falsos negativos;A temperatura de recocido demasiado baixa pode provocar unha amplificación non específica e reducir a eficiencia da amplificación específica.Afecta moito á combinación de cebadores e modelos para reducir a eficiencia da amplificación da PCR.Ás veces é necesario utilizar termómetros estándar para detectar a variabilidade, o recocido e a temperatura prolongada na cociña de extensión ou hidrosoluble, que é unha das razóns do fallo da PCR.

Variantes da secuencia diana: se se produce a secuencia diana, unha mutación ou deleción, se combina a combinación do prototipo e o modelo, ou debido á falta dunha secuencia diana, o cebador e o molde perderán a secuencia complementaria, e a súa amplificación por PCR non terá éxito.

● Falso positivo

A banda de amplificación da PCR parece consistente coa banda da secuencia diana, e ás veces a súa banda é máis ordenada e máis alta.

O deseño do cebador non é apropiado: a secuencia de amplificación seleccionada e a secuencia de amplificación sen propósito teñen homóloga, polo que cando a amplificación por PCR, os produtos de PCR amplificados son secuencias sen propósito.A secuencia diana é demasiado curta ou o cebador é demasiado curto, e é propenso a falsos positivos.Hai que redeseñar.

Contaminación cruzada da secuencia diana ou produtos de amplificación: hai dúas razóns para esta contaminación: En primeiro lugar, a contaminación cruzada de todo o xenoma ou de grandes segmentos, que leva a falsos positivos.Este tipo de falso positivo pódese resolver mediante os seguintes métodos: Teña coidado e coidado durante a operación para evitar que a secuencia de destino se inhala na pistola de mostra ou salpique fóra do tubo centrífugo.Salvo encimas e substancias que non poden soportar altas temperaturas, todos os reactivos ou equipos deben desinfectarse con alta presión.Os tubos centrífugos e as mostras deben usarse ao mesmo tempo.Cando é necesario, antes de engadir mostras, o tubo de reacción e o reactivo expóñense a raios ultravioleta para destruír o ácido nucleico existente.En segundo lugar, pequenos fragmentos na contaminación do aire.Estes pequenos fragmentos son máis curtos que a secuencia diana, pero teñen certa homoloxía.Pódese empalmar entre si.Despois de complementar os cebadores, o produto da PCR pódese expandir, o que provocará a produción de falsos positivos.Pódese usar para reducir ou eliminar o método de PCR do niño.

● Aparece banda de amplificación inespecífica

As bandas que apareceron despois da amplificación por PCR son inconsistentes co tamaño esperado, ben grandes ou pequenos, ou ao mesmo tempo, ou ao mesmo tempo, bandas de amplificación específicas e bandas de amplificación non específicas.A aparición de bandas non específicas é: En primeiro lugar, os cebadores son complementarios incompletos da secuencia diana, ou a polimerización do cebador para formar un di cluster.O segundo é que a concentración de ións MG2+ é demasiado alta, a temperatura de recocido é demasiado baixa e o número de ciclos de PCR está relacionado.En segundo lugar, a calidade e cantidade de encimas.Moitas veces, os encimas dalgunhas fontes son propensos a bandas non especiais e os encimas da outra fonte non se producen.Ás veces tamén se produce a amplificación inespecífica de encimas.As contramedidas son: redeseñar atractivos se é necesario.Reducir a cantidade de encima ou substituír a encima doutra fonte.Reducir a cantidade de primaria, aumentar a cantidade de modelos adecuadamente e reducir o número de ciclos.Aumente adecuadamente a temperatura de recocido ou use o método de dous puntos de temperatura (dexeneración de 93 °C, recocido e estendendo a uns 65 °C).

● Aparece estopa escamosa ou cinta de frotis

A amplificación por PCR ás veces parece ser aplicada ou descascarada ou cinto tipo alfombra.Por iso, debido á cantidade excesiva de encimas ou á mala calidade do encima, a concentración de dNTP é demasiado alta, a concentración de Mg2+ é demasiado alta, a temperatura de recocido é demasiado baixa e o número de ciclos é demasiado.As contramedidas son: ①Reducir a cantidade de encimas ou cambiar a encima doutra fonte.②Reducir a concentración de dNTP ③Reducir correctamente a concentración de Mg2+.④Aumenta a cantidade de modelos e reduce o número de ciclos.

Produtos relacionados

PCR Heroᵀᴹ (con colorante)

◮ Maior fidelidade: 6 veces a enzima Taq común;

◮ Velocidade de amplificación máis rápida

◮ Máis adaptabilidade de modelos

◮ Maior eficiencia de amplificación

◮ A tolerancia ambiental é máis forte: colócase a 37 °C durante unha semana, mantendo máis do 90% de actividade;

◮ Ten actividade ADN polimerase 5'→3' e actividade exonuclease 5'→3', sen actividade exonuclease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (con colorante)

O sistema de reacción único e a Taq DNA Polymerase de alta eficiencia fan que a reacción de PCR teña unha maior eficiencia de amplificación, especificidade e sensibilidade.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ O kit dun paso fai que a transcrición inversa e a qPCR sexan dúas reaccións no mesmo tubo, só é necesario engadir ARN modelo, cebadores específicos de PCR e ddH sen RNase.₂O.

◮ O kit pode analizar cuantitativamente de forma rápida e eficiente o ARN viral ou trazar o ARN.

◮ O kit usa un reactivo de transcrición inversa Foregene exclusivo e Foregene HotStar Taq DNA Polymerase combinado cun sistema de reacción único para mellorar eficazmente a eficiencia e especificidade da amplificación da reacción.

◮ O sistema de reacción optimizado fai que a reacción teña unha maior sensibilidade de detección, unha maior estabilidade térmica e unha mellor tolerancia.

◮ RT-qPCR fácil^TM(One Step)-O kit SYBR Green I inclúe un tinte de referencia interno ROX, que se pode usar para eliminar os erros de sinal de fondo e de sinal entre os pozos, o que é conveniente para que os clientes o usen en diferentes modelos de instrumentos de PCR cuantitativos.

RT Fácil^TMII (Premestura mestra para síntese de ADNc da primeira cadea paraPCR en tempo real)

-Capacidade eficiente para eliminar gDNA, que pode eliminar gDNA do modelo en 2 minutos.

-Eficiente sistema de transcrición inversa, só leva 15 minutos completar a síntese da primeira cadea de ADNc.

-Modelos complexos: os modelos con alto contido de GC e estrutura secundaria complexa tamén se poden reverter con alta eficiencia.

-Sistema de transcrición inversa de alta sensibilidade, os modelos de nivel pg tamén poden obter ADNc de alta calidade.

-O sistema de transcrición inversa ten unha alta estabilidade térmica, a temperatura de reacción óptima é de 42 ℃ e aínda ten un bo rendemento de transcrición inversa a 50 ℃.