A PCR é a tecnoloxía de amplificación de ácidos nucleicos máis usada e é moi utilizada pola súa sensibilidade e especificidade.Non obstante, a PCR require unha desnaturalización térmica repetida e non pode desfacerse das limitacións de depender de instrumentos e equipos, o que limita a súa aplicación nas probas de campo clínico.

Desde principios da década de 1990, moitos laboratorios comezaron a desenvolver tecnoloxía de amplificación de temperatura constante que non require desnaturalización térmica.Agora desenvolveron tecnoloxía de amplificación isotérmica mediada por bucle, tecnoloxía de amplificación isotérmica de substitución de febras, tecnoloxía de amplificación isotérmica de círculo rodante e dependencia da secuencia de ácidos nucleicos.Tecnoloxía de amplificación isotérmica e outras tecnoloxías. 

Lamplificación isotérmica mediada por oop

O principio de amplificación baséase no feito de que o ADN está nun estado de equilibrio dinámico a uns 65 °C.Cando calquera cebador está emparellado de bases e esténdese á parte complementaria do ADN de dobre cadea, a outra cadea disociarase e converterase en monocatenaria.

A esta temperatura, o ADN usa 4 cebadores específicos para depender dunha ADN polimerase de desprazamento de cadeas para facer que a síntese de ADN de desprazamento de febras circule continuamente.

Primeiro determine as 6 rexións específicas F3, F2, F1, B1, B2, B3 no xene diana e despois deseña 4 cebadores baseados nestas 6 rexións específicas (como se mostra na figura seguinte):

O cebador interno directo (FIP) está composto por F1c e F2.

O cebador interno cara atrás (BIP) está composto por B1c e B2, e TTTT utilízase como separador no medio.

Os cebadores externos F3 e B3 están compostos respectivamente por rexións F3 e B3 do xene diana.

No sistema de reacción LAMP, a concentración do cebador interno é varias veces a do cebador externo.O cebador interno combínase primeiro coa cadea molde para sintetizar unha cadea complementaria para formar unha dobre cadea de ADN.Posteriormente, o cebador externo combínase coa cadea molde para formar unha dobre cadea de ADN.Baixo a acción da BstDNA polimerase, libera a cadea complementaria sintetizada polo cebador interno.Despois dunha serie de reaccións, a cadea complementaria finalmente forma unha única cadea de ADN cunha estrutura de mancuernas.

A propia cadea de ADN da estrutura de mancuernas úsase como modelo para formar continuamente un ADN de estrutura de bucle de talo de transición cun extremo aberto.Os cebadores internos e externos guían o ADN da estrutura de bucle de talo de transición para sufrir continuamente reaccións de desprazamento e extensión da cadea e, finalmente, formar múltiples estruturas de bucle de talo con diferentes lonxitudes.mestura de ADN.

Vantaxes e inconvenientes da amplificación isotérmica mediada por bucle

Vantaxes de LAMP:

(1) Alta eficiencia de amplificación, que pode amplificar efectivamente de 1 a 10 copias do xene diana en 1 hora, e a eficiencia de amplificación é de 10 a 100 veces a da PCR ordinaria.

(2) O tempo de reacción é curto, a especificidade é forte e non se require ningún equipo especial.

Deficiencias de LAMP:

(1) Os requisitos para imprimacións son especialmente elevados.

(2) O produto amplificado non se pode usar para a clonación e a secuenciación, senón que só se pode utilizar para o xuízo.

(3) Debido á súa forte sensibilidade, é fácil formar aerosois, causando falsos positivos e afectando os resultados das probas.

Samplificación de desprazamento de trand

A amplificación por desprazamento de febras (SDA) é unha técnica de amplificación isotérmica de ADN in vitro baseada na reacción enzimática proposta por primeira vez polo estudoso estadounidense Walker en 1992.

O sistema básico da SDA inclúe unha endonuclease de restrición, unha ADN polimerase con actividade de desprazamento da cadea, dous pares de cebadores, dNTPs e ións calcio e magnesio e sistemas tampón.

O principio da amplificación por desprazamento da cadea baséase na secuencia de recoñecemento de endonuclease de restrición modificada químicamente en ambos os extremos do ADN diana.A endonuclease abre a fenda da cadea de ADN no seu sitio de recoñecemento, e a ADN polimerase estende a fenda 3′ do extremo e substitúe a seguinte febra de ADN.

As cadeas simples de ADN substituídas pódense combinar con cebadores e estenderse a cadeas dobres pola ADN polimerase.Este proceso repítese continuamente, de xeito que a secuencia obxectivo é eficientemente amplificada.

Vantaxes e inconvenientes da tecnoloxía de amplificación por desprazamento de febras

Vantaxes do SDA:

A eficiencia de amplificación é alta, o tempo de reacción é curto, a especificidade é forte e non se require ningún equipo especial.

Deficiencias do SDA:

Os produtos non son uniformes, e algúns produtos monocatenarios e de dobre cadeas prodúcense sempre no ciclo SDA, e inevitablemente producirase un descenso cando se detecte pola electroforese.

Ramplificación do círculo de olling

A amplificación do círculo rodante (RCA) proponse baseándose no método de copia do ADN de organismos patóxenos mediante un círculo rodante.Refírese ao uso de ADN circular monocatenario como molde a unha temperatura constante, e unha ADN polimerase especial (como Phi29) ) Baixo a acción da síntese de ADN en círculo rodante para conseguir a amplificación do xene obxectivo.

RCA pódese dividir en amplificación lineal e amplificación exponencial.A eficiencia do RCA lineal pode chegar a 10⁵veces, e a eficiencia do RCA exponencial pode chegar a 10⁹veces.

Distinción simple, como se mostra na figura seguinte, a amplificación lineal a só usa 1 cebador, a amplificación exponencial b ten 2 cebadores.

O RCA lineal tamén se denomina RCA de cebador único.Un cebador únese ao ADN circular e esténdese pola acción da ADN polimerase.O produto é unha cadea simple lineal cun gran número de secuencias repetitivas miles de veces a lonxitude dun único bucle.

Dado que o produto do RCA lineal está sempre conectado ao cebador de partida, a fácil fixación do sinal é unha vantaxe importante.

RCA exponencial, tamén coñecida como HRCA de amplificación hiperramificada (RCA hiperramificada), en RCA exponencial, un cebador amplifica o produto RCA, o segundo cebador hibrida co produto RCA e esténdese, e a substitución xa está unida ao produto RCA.

As vantaxes e desvantaxes da amplificación de ácidos nucleicos en círculo rodante

Vantaxes de RCA:

Alta sensibilidade, boa especificidade e fácil operación.

Deficiencias de RCA:

Problemas de fondo durante a detección do sinal.Durante a reacción RCA, a sonda de cadeado sen circular e o ADN ou ARN modelo da sonda non unida poden xerar algúns sinais de fondo. 

NAmplificación baseada en secuencias do ácido ucleico

A amplificación baseada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) é unha nova tecnoloxía desenvolvida sobre a base da PCR.Trátase dunha amplificación continua e isotérmica de ácidos nucleicos guiada por un par de cebadores cunha secuencia promotora T7.A tecnoloxía pode amplificar o ARN modelo unhas 109 veces en aproximadamente 2 horas, o que é 1000 veces maior que o método de PCR convencional e non require equipos especiais.

Esta tecnoloxía utilizouse para o diagnóstico rápido de enfermidades tan pronto como apareceu, e moitas empresas utilizan actualmente este método en kits de detección de ARN.

Aínda que a amplificación de ARN tamén pode usar a tecnoloxía de PCR de transcrición inversa, NASBA ten as súas propias vantaxes: pode levarse a cabo en condicións de temperatura relativamente constantes e é máis estable e precisa que a tecnoloxía tradicional de PCR.

A reacción está a 41 graos centígrados e require a transcriptase inversa de AMV (virus da mieloblastose aviar), RNase H, ARN polimerase T7 e un par de cebadores para completar.

O proceso inclúe principalmente:

O cebador directo contén a secuencia complementaria do promotor T7.Durante a reacción, o cebador directo únese á cadea de ARN e é catalizado polo encima AMV para formar unha dobre cadea ADN-ARN.

A RNase H dixere o ARN no híbrido de dobre cadea e retén o ADN monocatenario.

Baixo a acción do cebador inverso e do encima AMV, fórmase unha dobre cadea de ADN que contén a secuencia do promotor T7.

Baixo a acción da ARN polimerase T7, complétase o proceso de transcrición e prodúcese unha gran cantidade de ARN diana.

Vantaxes de NASBA:

(1) O seu cebador ten unha secuencia promotora T7, pero o ADN de dobre cadea estraño non ten secuencia promotora T7 e non se pode amplificar, polo que esta tecnoloxía ten unha especificidade e sensibilidade elevadas.

(2) NASBA incorpora directamente o proceso de transcrición inversa na reacción de amplificación, acurtando o tempo de reacción.

Desvantaxes de NASBA:

(1) Os compoñentes da reacción son máis complicados.

(2) Requírense tres tipos de encimas para aumentar o custo da reacción.