A PCR en tempo real, tamén coñecida como PCR cuantitativa ou qPCR, é un método de seguimento e análise en tempo real dos produtos de amplificación da PCR.
Dado que a PCR cuantitativa ten as vantaxes dunha operación sinxela, rápida e cómoda, alta sensibilidade, boa repetibilidade e baixa taxa de contaminación, úsase amplamente en probas médicas, avaliación da eficacia de fármacos, investigación da expresión xénica, investigación transxénica, detección de xenes, detección de patóxenos, detección de animais e plantas., probas de alimentos e outros campos.
Polo tanto, tanto se estás dedicado a investigación básica en ciencias da vida, como empregados de empresas farmacéuticas, empresas gandeiras, empresas de alimentos ou mesmo empregados de oficinas de inspección de entrada-saída e corentena, departamentos de vixilancia ambiental, hospitais e outras unidades, estarás máis ou menos exposto ou necesitas coñecer os coñecementos sobre o dominio da PCR cuantitativa.

Principio de PCR en tempo real

A PCR en tempo real é un método no que se engaden substancias fluorescentes ao sistema de reacción da PCR, e a intensidade do sinal de fluorescencia no proceso de reacción da PCR é controlada en tempo real mediante un instrumento de PCR cuantitativo e, finalmente, analízanse e procesan os datos experimentais.

【Curva de amplificación】é a curva que describe o proceso dinámico da PCR.A curva de amplificación da PCR non é en realidade unha curva exponencial estándar, senón unha curva sigmoide.

[Curva de amplificación da fase de plataforma]Co aumento do número de ciclos de PCR, a inactivación da ADN polimerase, o esgotamento de dNTPs e cebadores e a inhibición da reacción de síntese polo pirofosfato do subproduto da reacción, etc., a PCR non sempre se expande exponencialmente., e finalmente entrará nunha meseta.

[Rexión de crecemento exponencial da curva de amplificación]Aínda que a fase meseta varía moito, nunha determinada rexión da rexión de crecemento exponencial da curva de amplificación, a repetibilidade é moi boa, o que é moi importante para a análise cuantitativa da PCR.

[Valor limiar e valor Ct]Establecemos o valor límite da detección de fluorescencia na posición adecuada na área de crecemento exponencial da curva de amplificación, é dicir, o valor límite (Limiar).A intersección do valor limiar e a curva de amplificación é o valor Ct, é dicir, o valor Ct refírese ao número de ciclos (Threshold Cycle) cando se alcanza o valor limiar.

O seguinte gráfico mostra claramente a relación entre a liña de limiar e a curva de amplificación, o limiar e o valor Ct.

【Como cuantificar?】

Probouse pola teoría matemática que o valor Ct ten unha relación lineal inversa co logaritmo do número de modelos iniciais.Real Time PCR monitoriza os produtos de amplificación da PCR en tempo real e cuantificaos durante a fase de amplificación exponencial.

Para cada ciclo de PCR, o ADN aumentou exponencialmente 2 veces, e pronto alcanzou unha meseta.

Asumindo que a cantidade de ADN inicial é A₀ , despois de n ciclos, a cantidade teórica de produto de ADN pódese expresar como:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Entón, canto maior sexa a cantidade inicial de ADN A 0, máis cedo a cantidade de produto amplificado alcanza o valor de detección An , e o número de ciclos ao chegar a An é o valor Ct.É dicir, canto maior sexa a cantidade inicial de ADN A 0, máis cedo chegarán os picos da curva de amplificación e, en consecuencia, o número necesario de ciclos n é menor.

Realizamos a dilución en gradiente do patrón de concentración coñecida e usámolo como molde para a PCR en tempo real, e obteranse unha serie de curvas de amplificación a intervalos iguais na orde de cantidade de ADN inicial de máis a menos.Segundo a relación lineal entre o valor Ct e o logaritmo do número de modelos iniciais, a[curva estándar] pódese crear.

Ao substituír o valor Ct da mostra con concentración descoñecida na curva estándar, pódese obter a cantidade inicial de modelo da mostra con concentración descoñecida, que é o principio cuantitativo da PCR en tempo real.

Método de detección de PCR en tempo real

A PCR en tempo real detecta produtos de amplificación da PCR detectando a intensidade da fluorescencia no sistema de reacción.

Principio do método de incorporación de colorantes fluorescentes】

Colorantes fluorescentes, como TB Green ® , poden unirse de forma inespecífica ao ADN de dobre cadea nos sistemas de PCR e emitir fluorescencia ao unirse.

A intensidade de fluorescencia no sistema de reacción aumentou exponencialmente co aumento dos ciclos de PCR.Ao detectar a intensidade da fluorescencia, a cantidade de amplificación do ADN no sistema de reacción pódese controlar en tempo real e, a continuación, pódese estimar inversamente a cantidade de molde de partida na mostra.

【Principio do método de sonda fluorescente】

sonda fluorescenteé unha secuencia de ácidos nucleicos cun grupo fluorescente no extremo 5′ e un grupo de extinción no extremo 3′, que pode unirse especificamente ao molde.Cando a sonda está intacta, a fluorescencia emitida polo fluoróforo é extinguida polo grupo de extinción e non pode emitir fluorescencia.Cando a sonda se descompón, a substancia fluorescente disociarase e emitirá fluorescencia.

Engádese unha sonda fluorescente á solución de reacción de PCR.Durante o proceso de recocido, a sonda fluorescente unirase á posición específica do molde.Durante o proceso de extensión, a actividade exonuclease 5′→3′ do encima da PCR pode descompoñer a sonda fluorescente hibridada coa plantilla, e a substancia fluorescente disociase para emitir fluorescencia.Ao detectar a intensidade de fluorescencia da sonda no sistema de reacción, pódese conseguir o propósito de controlar a cantidade de amplificación do produto da PCR.

【Selección do método de detección de fluorescencia】

Se se usa para distinguir secuencias con alta homoloxía e realizar a detección por PCR múltiple como a análise de tipificación de SNP, o método da sonda fluorescente é insubstituíble.
Para outros experimentos de PCR en tempo real, pódese utilizar un método de quimera fluorescente sinxelo, sinxelo e de baixo custo.

sondasForte especificidade, capaz de PCR múltiple

Deficiencia

Requisitos de alta especificidade para a amplificación;

non se pode realizar a PCR múltiplexPrecisa de deseñar sondas específicas, custo elevado;

ás veces o deseño da sonda é difícil

Produtos relacionados: