O valor Ct é a forma de presentación de resultados máis importante da PCR cuantitativa fluorescente.Utilízase para calcular diferenzas de expresión xénica ou número de copias xenéticas.Entón, cal se considera razoable o valor Ct da cuantificación de fluorescencia?Como garantir o rango efectivo do valor Ct?
Cal é o valor Ct?
Durante o proceso de amplificación qPCR, o número correspondente de ciclos de amplificación (Limiar de ciclo) cando o sinal de fluorescencia do produto amplificado alcanza o limiar de fluorescencia establecido.C significa Ciclo e T significa Limiar.En pocas palabras, o valor Ct é o número de ciclos correspondentes a cando a amplificación inicial da plantilla alcanza unha certa cantidade de produto na qPCR.O chamado "unha determinada cantidade de produto" explicarase máis adiante.
Que fai o valor Ct?
1.Relación entre a amplificación exponencial, a cantidade de modelo e o valor Ct
Idealmente, os xenes na qPCR acumúlanse mediante amplificación exponencial despois dun certo número de ciclos.A relación entre o número de ciclos de amplificación e a cantidade de produtos é: Cantidade de produto amplificado = cantidade inicial de modelo × número de ciclos (1+En).Non obstante, a reacción qPCR non sempre está nunha situación ideal.Cando a cantidade de produto amplificado alcanza unha "determinada cantidade de produto", o número de ciclos neste momento é o valor Ct, e está no período de amplificación exponencial.A relación entre o valor Ct e a cantidade de modelo inicial: hai unha relación lineal entre o valor Ct do modelo e o logaritmo do número de copia inicial do modelo.Canto maior sexa a concentración inicial do molde, menor será o valor de Ct;canto menor sexa a concentración inicial do modelo, maior será o valor de Ct.
2.Curva de amplificación, limiar de fluorescencia e certa cantidade de produto de PCR
A cantidade de produto de amplificación qPCR preséntase directamente en forma de sinal fluorescente, é dicir, a curva de amplificación.Na fase inicial da PCR, a amplificación está en condicións ideais, o número de ciclos é pequeno, a acumulación de produtos é pequena e o nivel de fluorescencia non se pode distinguir claramente do fondo de fluorescencia.Despois diso, a fluorescencia aumenta e entra na fase exponencial.A cantidade de produto da PCR pódese detectar nun momento determinado cando a reacción de PCR está só na fase exponencial, que se pode usar como "unha determinada cantidade de produto", e disto pódese deducir o contido inicial do modelo.Polo tanto, a intensidade do sinal de fluorescencia correspondente a unha determinada cantidade de produto é o limiar de fluorescencia.
Na fase final da PCR, a curva de amplificación xa non mostra amplificación exponencial e entra na fase lineal e na fase meseta.
3.Reproducibilidade dos valores Ct
Cando o ciclo de PCR alcanza o número de ciclo do valor Ct, acaba de entrar no período de amplificación exponencial verdadeiro.Neste momento, o pequeno erro non se amplificou, polo que a reproducibilidade do valor Ct é excelente, é dicir, a mesma plantilla amplificase en diferentes momentos ou en diferentes tubos ao mesmo tempo.Amplificación, o valor Ct obtido é constante.
1.Eficiencia de amplificación En
A eficiencia da amplificación da PCR refírese á eficiencia coa que a polimerase converte o xene para amplificar nun amplicón.A eficiencia de amplificación cando unha molécula de ADN se transforma en dúas moléculas de ADN é do 100%.A eficiencia de amplificación exprésase habitualmente como En.Co fin de facilitar a análise dos artigos posteriores, preséntanse brevemente os factores que afectan á eficiencia da amplificación.
| Factores que inflúen | explicación | Como xulgar? |
| A. Inhibidores da PCR | 1. O ADN molde contén substancias que inhiben a reacción da PCR, como proteínas ou deterxentes.2. O ADNc despois da transcrición inversa contén unha alta concentración de ARN molde ou compoñentes dos reactivos RT, que tamén poden inhibir a reacción posterior de PCR. | 1. Pódese xulgar se hai contaminación medindo a relación entre A260/A280 e A260/A230 ou electroforese de ARN.2. Se o ADNc se dilúe segundo unha determinada proporción despois da transcrición inversa. |
| B. Deseño de imprimación inadecuado | Os cebadores non recocidon de forma eficiente | Comprobe os imprimadores para detectar dímeros de imprimación ou horquillas, desaxustes e, ás veces, deseños intrónicos. |
| C. Deseño incorrecto do programa de reacción de PCR | 1. Os imprimadores non poden recocer de forma eficaz2. Liberación insuficiente de ADN polimerase 3. A actividade da ADN polimerase a alta temperatura a longo prazo diminuíu | 1. A temperatura de recocido é superior ao valor TM da imprimación2. O tempo de pre-desnaturalización é demasiado curto 3. O tempo de cada etapa do procedemento de reacción é demasiado longo |
| D. Mestura insuficiente dos reactivos ou erros de pipeteo | No sistema de reacción, a concentración local dos compoñentes da reacción da PCR é demasiado alta ou desigual, o que resulta nunha amplificación non exponencial da amplificación da PCR | |
| E. Lonxitude do amplicón | A lonxitude do amplicón é demasiado longa, supera os 300 bp e a eficiencia de amplificación é baixa | Comprobe que a lonxitude do amplicón estea entre 80-300 bp |
| F. Influencia dos reactivos qPCR | A concentración de ADN polimerase no reactivo é baixa ou a concentración de ións no tampón non está optimizada, polo que a actividade do encima Taq non alcanza o máximo. | Determinación da eficiencia de amplificación por curva estándar |
2.Rango de valores Ct
Os valores de Ct oscilan entre 15 e 35.Se o valor Ct é inferior a 15, considérase que a amplificación está dentro do intervalo do período de referencia e non se alcanzou o limiar de fluorescencia.Idealmente, hai unha relación lineal entre o valor Ct e o logaritmo do número de copia inicial do modelo, é dicir, a curva estándar.A través da curva estándar, cando a eficiencia de amplificación é do 100 %, o valor de Ct calculado para cuantificar o número de copia única do xene sitúase en torno a 35. Se é superior a 35, o número de copia inicial do modelo é teoricamente inferior a 1, o que pode considerarse sen sentido.
Para diferentes intervalos de xenes Ct, debido á diferenza no número de copias do xene e na eficiencia da amplificación na cantidade inicial do molde, é necesario facer unha curva estándar para o xene e calcular o rango de detección lineal do xene.
3.Factores influyentes do valor Ct
A partir da relación entre o número de ciclos de amplificación e a cantidade de produto: cantidade de produto amplificado = cantidade de modelo inicial × (1+En) número de ciclo, pódese ver que, en condicións ideais, a cantidade de modelo inicial e En terán un impacto negativo sobre o valor de Ct.A diferenza na calidade do modelo ou na eficiencia da amplificación fará que o valor Ct sexa demasiado grande ou demasiado pequeno.
O valor 4.Ct é demasiado grande ou moi pequeno
Hora de publicación: 22-feb-2023
