A perda auditiva (HL) é a enfermidade sensorial máis común en humanos.Nos países desenvolvidos, preto do 80% dos casos de xordeira prelingual en nenos son causados ​​por factores xenéticos.Os máis comúns son os defectos dun só xene (como se mostra na figura 1), 124 mutacións xenéticas están asociadas á perda auditiva non sindrómica en humanos, o resto son causadas por factores ambientais.Un implante coclear (un dispositivo electrónico colocado no oído interno que proporciona estimulación eléctrica directamente ao nervio auditivo) é, con diferenza, a opción máis eficaz para tratar o HL grave, mentres que un audífono (un dispositivo electrónico externo que converte e amplifica as ondas sonoras) pode axudar aos pacientes con HL moderado.Non obstante, actualmente non hai medicamentos dispoñibles para tratar o HL hereditario (GHL).Nos últimos anos, a terapia xénica recibiu unha atención cada vez maior como un enfoque prometedor para tratar a disfunción do oído interno.

Fig1.Distribución do tipo de variación asociada á xordeira.[1]

Recentemente, científicos do Instituto Salk e da Universidade de Sheffield publicaron un resultado da investigación en Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], que amosou amplas perspectivas de aplicación da terapia xénica in vivo da xordeira hereditaria.Uri Manor, profesor asistente de investigación do Instituto Salk e director do Centro Waitt de Biofotónica Avanzada, dixo que naceu cunha perda auditiva grave e que sentía que restaurar a audición sería un agasallo marabilloso.A súa investigación previa atopou que Eps8 é unha proteína reguladora da actina con actividades de unión e captación de actina;nas células ciliadas cocleares, o complexo proteico formado por Eps8 con MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 e GNAI3 existe principalmente na maioría As puntas dos estereocilios longos, que xunto co MYO15A localizan a BAIAP2L2 nas puntas dos estereocilios máis curtos, son necesarias para o mantemento dos feixes de pelo.Polo tanto, Eps8 pode regular a lonxitude dos estereocilios das células ciliadas, o que é esencial para a función auditiva normal;A eliminación ou a mutación do Eps8 levará a estereocilios curtos, que o fan incapaz de converter correctamente o son en sinais eléctricos para a percepción cerebral, o que á súa vez leva á xordeira..Ao mesmo tempo, o colaborador Walter Marcotti, profesor da Universidade de Sheffield, descubriu que as células ciliadas non poden desenvolverse normalmente en ausencia de Eps8.Neste estudo, Manor e Marcotti uníronse para investigar se engadir Eps8 ás células estereociliares podería restaurar a súa función e, á súa vez, mellorar a audición nos ratos.O equipo de investigación utilizou o vector de virus adeno-asociado (AAV) Anc80L65 para entregar a secuencia codificante que contén EPS8 de tipo salvaxe na cóclea de ratos P1-P2 recén nacidos Eps8-/- mediante inxección de membrana de ventá redonda;nas células ciliadas cocleares de rato A función dos estereocilios reparouse antes de que madurasen;e o efecto de reparación caracterizouse pola tecnoloxía de imaxe e a medición de estereocilios.Os resultados mostraron que Eps8 aumentou a lonxitude dos estereocilios e restableceu a función das células ciliadas nas células de baixa frecuencia.Tamén descubriron que, co paso do tempo, as células parecían perder a súa capacidade de ser rescatadas por esta terapia xénica.A implicación é que este tratamento pode ter que ser administrado no útero, xa que as células ciliadas Eps8-/- poden madurar ou acumular danos irreparables despois do nacemento dos ratos."Eps8 é unha proteína con moitas funcións diferentes, e aínda hai moito que explorar", dixo Manor.As investigacións futuras incluirán investigar o efecto da terapia xénica Eps8 na restauración da audición en diferentes etapas de desenvolvemento e se é posible prolongar as oportunidades de tratamento.Casualmente, en novembro de 2020, a profesora KarenB Avraham da Universidade de Tel Aviv en Israel publicou os seus resultados na revista EMBO Molecular Medicine [3], utilizando unha innovadora tecnoloxía de terapia xénica para crear un virus sintético inofensivo asociado a adenovirus AAV9-PHP.B, O defecto xenético das células ciliadas dos ratos Syne4-/- foi reparado inxectando un virus que levaba a secuencia codificante de Syne4 no oído interno dos ratos, permitíndolle entrar nas células ciliadas e liberar o material xenético transportado, permitíndolles madurar e funcionar normalmente (como na figura 2).

Fig2.Representación esquemática da anatomía do oído interno, con foco no órgano de Corti e a función celular de nesprin-4.

Pódese ver que o uso da terapia xénica para acadar o propósito de tratar enfermidades hereditarias a nivel xenético mediante a inserción, eliminación ou corrección de calquera xene mutado para o tratamento (é dicir, controlar os cambios xenéticos da enfermidade) ten un alto efecto clínico.perspectivas de aplicación.Os métodos actuais de terapia xénica para a xordeira xeneticamente deficiente pódense dividir nas seguintes categorías:

substitución xenética

A substitución de xenes é, sen dúbida, a forma máis "directa" de terapia xénica, baseada na identificación e substitución dun xene defectuoso por unha copia normal ou salvaxe do xene.Primeiro estudo exitoso de terapia xénica do oído interno para a perda auditiva causada pola deleción do xene do transportador vesicular de glutamato 3 (VGLUT3);A entrega mediada por AAV1 de sobreexpresión esóxena de VGLUT3 nas células ciliadas do oído interno (IHC) pode producir unha recuperación sostida da audición, unha recuperación parcial da morfoloxía sináptica da cinta e respostas convulsivas [4].Non obstante, nos exemplos que inclúen as dúas substitucións xenéticas proporcionadas por AAV descritas na introdución anterior, é importante ter en conta que os modelos de rato utilizados para certos tipos de trastornos hereditarios de perda auditiva de eliminación de xenes son temporalmente diferentes dos humanos, e nos ratos P1, o oído interno atópase na fase madura de desenvolvemento.Pola contra, os humanos nacemos cun oído interno maduro.Esta diferenza impide a posible aplicación dos resultados do rato ao tratamento de trastornos hereditarios de xordeira humana a non ser que a terapia xénica se administre aos oídos maduros do rato.

Edición de xenes: CRISPR/Cas9

En comparación coa "substitución xenética", o desenvolvemento da tecnoloxía de edición de xenes trouxo o albor do tratamento das enfermidades xenéticas desde a raíz.É importante destacar que o método de edición de xenes compensa as deficiencias dos métodos tradicionais de terapia xénica de sobreexpresión que non son axeitados para as enfermidades de xordeira hereditaria dominante e o problema de que o método de sobreexpresión non dura moito.Despois de que os investigadores chineses eliminasen especificamente o alelo mutante Myo6C442Y en ratos Myo6WT/C442Y usando o sistema de edición de xenes AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, e dentro dos 5 meses posteriores ao knockout, os ratos restauráronse a función auditiva do modelo;ao mesmo tempo, tamén se observou que a taxa de supervivencia das células ciliadas no oído interno mellorou, a forma dos cilios fíxose regular e os indicadores electrofisiolóxicos foron corrixidos [5].Este é o primeiro estudo no mundo que utiliza a tecnoloxía CRISPR/Cas9 para o tratamento da xordeira hereditaria causada pola mutación do xene Myo6, e é un importante avance da investigación da tecnoloxía de edición de xenes para o tratamento da xordeira hereditaria.A tradución clínica do tratamento proporciona unha base científica sólida.

Métodos de administración de terapia xénica

Para que a terapia xénica teña éxito, as moléculas de ADN espidas non poden penetrar nas células de forma eficaz debido á súa hidrofilia e á súa carga negativa de grupos fosfato, e para garantir a integridade das moléculas de ácido nucleico suplementadas, debe seleccionarse un método seguro e eficaz.O ADN suplementado entrégase á célula ou tecido obxectivo.O AAV úsase amplamente como vehículo de administración para o tratamento de enfermidades debido ao seu alto efecto infeccioso, a súa baixa inmunoxenicidade e o amplo tropismo para varios tipos de tecidos.Na actualidade, un gran traballo de investigación determinou o tropismo de diferentes subtipos de AAV en relación con diferentes tipos de células na cóclea do rato.Usar as características de entrega de AAV combinadas con promotores específicos da célula pode lograr a expresión específica da célula, o que pode reducir os efectos fóra do obxectivo.Ademais, como alternativa aos vectores AAV tradicionais, están a desenvolverse constantemente novos vectores AAV sintéticos que mostran unha capacidade de transdución superior no oído interno, dos cales AAV2/Anc80L65 é o máis utilizado.Os métodos de entrega non virais pódense dividir en métodos físicos (microinxección e electroporación) e métodos químicos (base de lípidos, polímeros e nanopartículas de ouro).Ambos enfoques utilizáronse no tratamento de trastornos hereditarios de xordeira e mostraron diferentes vantaxes e limitacións.Ademais do vehículo de administración para a terapia xénica como vehículo, pódense empregar diferentes enfoques para a administración de xenes in vivo baseados en diferentes tipos de células diana, vías de administración e eficacia terapéutica.A complexa estrutura do oído interno dificulta o acceso ás células diana e a distribución dos axentes de edición do xenoma é lenta.O labirinto membranoso está situado dentro do labirinto óseo do óso temporal e inclúe o conduto coclear, o conduto semicircular, o utrículo e o globo.O seu illamento relativo, a circulación linfática mínima e a separación do sangue por unha barreira de labirinto sanguíneo limitan a entrega sistémica efectiva de terapéutica só aos ratos neonatais.Para obter títulos virais axeitados para a terapia xénica, é necesaria a inxección local directa de vectores virais no oído interno.As vías de inxección establecidas inclúen [6]: (1) membrana de ventá redonda (RWM), (2) traqueostomía, (3) cocleostomía endolinfática ou perilinfática, (4) membrana de ventá redonda máis fenestración de tubo (CF) (como na figura 3).

Fig3.Entrega do oído interno da terapia xénica.

Aínda que se realizaron moitos avances na terapia xénica, baseada en obxectivos clínicos de tradución, hai que traballar máis antes de que a terapia xénica poida converterse nunha opción de tratamento de primeira liña para pacientes con enfermidades xenéticas, especialmente no desenvolvemento de vectores e métodos de entrega seguros e eficaces.Pero cremos que nun futuro próximo, este tipo de tratamentos converteranse nun elemento básico da terapia personalizada e terán un impacto moi positivo na vida das persoas con trastornos xenéticos e das súas familias.

Foregene tamén lanzou un kit de cribado de alto rendemento para xenes dirixidos, que é rápido e pode realizar reaccións de transcrición inversa e qPCR sen extracción de ARN.

Ligazóns de produtos

Kit Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

Para obter máis información sobre o produto, póñase en contacto con:

overseas@foregene.com