A característica destacada da reacción de PCR é a súa gran capacidade de amplificación e unha sensibilidade extremadamente alta.Para mellorar o rendemento da PCR e a eficiencia da detección, estamos comprometidos a mellorar a capacidade de amplificación da PCR e a sensibilidade de detección, pero a dor de cabeza está no proceso do experimento.Moitas veces ocorren falsos positivos e unha cantidade moi pequena de contaminación cruzada da mostra ou contaminación do produto da PCR pode causar falsos positivos no experimento.
Cinco tipos de contaminación do produto PCR
Hai moitas razóns para a contaminación por PCR, que se poden dividir aproximadamente nas seguintes categorías:
A contaminación da mostra prodúcese principalmente pola contaminación do recipiente para recoller o espécimen, ou cando se coloca o espécimen, bótase fóra do recipiente debido ao selado solto ou a mostra está adherida ao exterior do recipiente, o que provoca contaminación cruzada;A contaminación leva á contaminación entre os exemplares;algúns espécimes microbianos, especialmente os virus, poden estenderse con aerosois ou formar aerosois, o que provoca unha contaminación mutua.
O motivo principal é que durante a preparación dos reactivos de PCR, a pistola de mostras, o recipiente, a auga destilada dobre e outras solucións están contaminadas polo molde de ácido nucleico da PCR.
Nos laboratorios de bioloxía molecular e nalgúns laboratorios que usan plásmidos clonados como controis positivos, tamén é común o problema da contaminación dos plásmidos clonados.Debido a que o contido do plásmido de clonación en volume unitario é bastante alto, e son necesarios máis ferramentas e reactivos no proceso de purificación, e é moi probable que o plásmido das células vivas estea contaminado debido ao forte crecemento e capacidade de reprodución das células vivas.
A contaminación dos produtos amplificados é o problema de contaminación máis común nas reaccións de PCR.Debido a que a cantidade de copias do produto de PCR é grande (xeralmente 1013 copias/ml), o que é moi superior ao límite do número de copias de detección de PCR, unha cantidade moi pequena de contaminación do produto de PCR pode causar falsos positivos.
A contaminación por aerosol é a forma máis probable de contaminación dos produtos de PCR, e tamén é a máis fácil de pasar por alto.Fórmase pola fricción entre a superficie líquida e o aire.Xeralmente, a contaminación do aerosol pódese formar cando se abre a tapa, cando se aspira a mostra ou mesmo cando se axita vigorosamente o tubo de reacción.Segundo os cálculos, unha partícula de aerosol pode conter 48.000 copias, polo que a contaminación que provoca é un problema que merece unha atención especial.
En particular, os laboratorios de probas adoitan usar o mesmo par de cebadores para probar un determinado xene.Co paso do tempo, unha gran cantidade de contaminación do produto PCR producirase no espazo do laboratorio.Unha vez que se produce tal contaminación, é difícil eliminala en pouco tempo.
Para os tres primeiros tipos de contaminación, podemos utilizar medios eficaces para evitar, pero a contaminación causada polos produtos de PCR é difícil de previr, especialmente na construción de laboratorios de PCR non estándar.No proceso de PCR, cando a punta da pipeta aspira e sopla o líquido e se abre a tapa do tubo de PCR, formarase un aerosol.As moléculas de ADN transportadas polo aerosol (un aerosol pode transportar decenas de miles de ADN) son difíciles de eliminar porque flotan no aire.Unha vez que se introduza a seguinte rolda de experimentos de PCR, inevitablemente ocorrerán falsos positivos.
Como se mostra na seguinte figura, o control negativo tamén amplificou a banda de interese correspondente:
A primeira parte deste número de contaminación e prevención por PCR preséntase aquí.O seguinte número traerávos a segunda parte "Prevención da contaminación dos produtos da PCR", así que estade atentos!
Hora de publicación: 25-Xul-2017
