Creo que todos atoparán tal ou cal problemas ao facer reaccións de PCR, pero a maioría deles pódense clasificar en dous problemas principais:

Demasiada pouca amplificación do modelo xenético (amplificación);
Demasiada amplificación de xenes non obxectivo.
O uso de aditivos é unha das estratexias habituais para resolver estes problemas.Normalmente o papel dos aditivos ten dous aspectos:
estrutura secundariados xenes (estrutura secundaria);
Reducir a imprimación inespecífica.
Hoxe, o editor presentarache brevemente os aditivos comúns nas reaccións de PCR e as súas funcións.
Aditivos que reducen a estrutura secundaria
sulfóxido(DMSO)
mostras de xenescun alto contido de GC.Non obstante, o DMSO tamén reduce moito a actividade da polimerase Taq.Polo tanto, todos teñen que equilibrar a accesibilidade da plantilla e a actividade da polimerase.O editor suxire que podes probar diferentes concentracións de DSMO, como do 2% ao 10%, para atopar a concentración que se adapte ao teu experimento.
Deterxentes non iónicos
Os deterxentes non iónicos, como 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 ou NP-40, adoitan reducir a estrutura secundaria do ADN.Aínda que isto pode aumentar a amplificación do xene modelo, tamén provocará problemas de amplificación inespecífica.Así, estes aditivos funcionan ben para reaccións de PCR de baixo rendemento sen residuos, pero non tan ben para reaccións de PRC relativamente impuras.Outro beneficio dos deterxentes non iónicos é a redución da contaminación por SDS.Normalmente, durante o proceso de extracción de ADN, a SDS levarase á etapa de PCR, o que inhibe en gran medida a actividade da polimerase.Polo tanto, engadir un 0,5% de Tween-20 ou Tween-40 á reacción pode neutralizar os efectos negativos do SDS.
Betaína_
A betaína pode mellorar a amplificación do ADN reducindo a formación de estruturas secundarias e xeralmente é unha adición "misteriosa" aos kits de PCR comerciais.Se queres usar betaína, debes poñer betaína ou betaína monohidrato (betaína ou betaína monohidrato), pero non clorhidrato de betaína (betaína HCl), axustar a unha concentración final de 1-1,7 M.A betaína tamén pode axudar a mellorar a especificidade porque elimina a dependencia da composición do par de bases da fusión do ADN/desnaturalización do ADN.
Aditivos para reducir imprimación inespecífica
Formamida
A formamida é un aditivo orgánico de PCR de uso común.Pode combinarse con suco maior e suco menor no ADN, reducindo así a estabilidade da dobre hélice do ADN mestre e baixando a temperatura de fusión do ADN.A concentración de formamida utilizada nos experimentos de PCR adoita ser do 1%-5%.
Tetrametilocloruro de amonio( TMAC)
O cloruro de tetrametilamonio pode aumentar a especificidade da hibridación (especificidade de hibridación) e aumentar a temperatura de fusión do ADN.Así, o TMAC pode eliminar o cebado non específico e reducir a unión incorrecta de ADN e ARN.Se usascebadores dexeneradosna reacción de PCR, recorda engadir TMAC, que se usa habitualmente nunha concentración de 15-100 mM.
Outros aditivos comúns
Ademais das dúas categorías de aditivos mencionadas anteriormente, hai moitos aditivos comúns nas reaccións de PCR, aínda que teñen diferentes funcións, tamén son moi importantes.
Ion magnesio
O ión magnesio é un cofactor (cofactor) indispensable da polimerase, é dicir, sen ión magnesio, a polimerase está inactiva.Non obstante, demasiados ións de magnesio tamén poden afectar a eficiencia da polimerase.A concentración de ións magnesio en cada reacción de PCR variará.Axentes quelantes (como EDTA ou citrato), a concentración de dNTPs e proteínas afectan a concentración de ións magnesio.Entón, se tes problemas co teu experimento de PCR, podes tentar cambiar diferentes concentracións de ións magnesio, por exemplo, de 1,0 a 4,0 mM, cun intervalo de 0,5 a 1 mM no medio.
Paga a pena notar que varios ciclos de conxelación e desconxelación poden levar á estratificación da concentración da solución de cloruro de magnesio.Polo tanto, debes disolvelo completamente antes de cada uso e mesturalo ben antes de usalo.
Albúmina sérica bovina(Albúmina bovina, BSA)
Nos experimentos de química molecular, a albúmina sérica bovina é un aditivo moi común, especialmente na dixestión con enzimas de restrición e experimentos de PCR.Nas reaccións de PCR, a BSA é útil para reducir contaminantes como os compostos fenólicos.E tamén se di que pode reducir a adhesión dos reactivos á parede do tubo de ensaio.Na reacción de PCR, normalmente a concentración de BSA engadido pode alcanzar os 0,8 mg/ml.
 
Produtos relacionados:
PCR Hero(con tintura)
PCR Hero