Verificar o rendemento dos cebadores e sondas na fase inicial dos reactivos de PCR e determinar as condicións de reacción máis adecuadas son os requisitos previos para garantir o bo progreso dos experimentos formais.
Entón, como necesitamos confirmar a sonda de cebador na fase inicial?
Os principais indicadores son a liña base, a curva de amplificación, o valor ct, a eficiencia da amplificación, a detección de mostras de baixa concentración, o CV, etc.
Liña base
A liña base é a liña horizontal na curva de amplificación da PCR.Nos primeiros ciclos da reacción de amplificación da PCR, o sinal de fluorescencia non cambia moito e forma unha liña recta.Esta liña recta é a liña de base.
Ao cribar as sondas de cebadores da PCR, preste atención a se a liña de base está nivelada.A pureza da concentración da sonda de cebador afectará á liña base, por exemplo, provocando que a liña base aumente ou caia.A liña de base tamén é un indicador moi intuitivo.
Curva de amplificación
Outro indicador intuitivo é a forma da curva de amplificación.O mellor é ter unha curva en forma de S para evitar a amplificación secundaria ou outras curvas de amplificación anormais.
Valor Ct
O número de ciclos correspondente ao punto de inflexión desde a liña base ata o crecemento exponencial é o valor Ct.
Para a mesma mostra, diferentes sondas de cebador dan lugar a diferentes curvas de amplificación, e o valor de Ct correspondente verase afectado pola eficiencia da amplificación e o grao de interferencia.En teoría, canto menor sexa o valor Ct da sonda de cebador que escollemos, mellor.
Eficiencia de amplificación
Un dos métodos máis fiables e estables para avaliar a eficiencia da amplificación da PCR é a curva estándar, que tamén é amplamente recoñecida polos investigadores.O método consiste en facer unha serie de mostras para controlar o número relativo de modelos obxectivo.Estas mostras adoitan facerse mediante dilucións en serie de solucións stock concentradas, a máis utilizada é a dilución de 10 veces.Utilizando unha serie de mostras diluídas, utilizando o programa estándar de qPCR para amplificar para obter o valor de Cq, e finalmente trazar unha curva estándar segundo a concentración de cada mostra e o valor de Cq correspondente para obter a ecuación lineal Cq= -klgX0+b, e a eficiencia de amplificación E=10(-1 /k)-1.Cando se usa qPCR para a análise cuantitativa, a eficiencia de amplificación debe estar no intervalo de 90%-110% (3,6>k>3,1).
Detección de mostras de baixa concentración
Cando a concentración da mostra é baixa, as taxas de detección das diferentes sondas de cebador son diferentes.Seleccionamos 20 mostras de baixa concentración para replicar, e o sistema cebador-sonda coa maior taxa de detección é o mellor.
Coeficiente de variación (CV)
Pódense detectar 10 mostras duplicadas con diferentes sondas de cebador segundo o estándar de liña do reactivo para a detección de amplificación de ácidos nucleicos.
Reactivos cuantitativos:
Precisión
A precisión nun lote debe cumprir: o coeficiente de variación (CV,%) do valor logarítmico da concentración de proba é ≤5%.Cando a concentración da mostra é baixa, o coeficiente de variación (CV,%) do logaritmo da concentración de detección é ≤10%
Reactivos cualitativos:
Precisión
A precisión nun lote debe cumprir:
(1) Coeficiente de variación do valor Ct (CV,%) ≤5%
A mesma mostra é probada en paralelo durante 10 veces, e os resultados da proba deben ser consistentes
Hora de publicación: 18-09-2021
