Autores: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Unidade: Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang Afiliado á Universidade de Tongji

Na actualidade, o principal tipo de mostra para a detección de ácidos nucleicos de patóxenos respiratorios é o cotonete de garganta.Existen moitos tipos de solucións de conservación de mostras de uso común, todas elas deben ser refrixeradas ou conxeladas para o seu transporte e almacenamento;É difícil controlar todo o proceso de baixa temperatura durante o proceso de recollida e transporte, e é difícil garantir o control de calidade antes da proba da mostra.^[1-2].

A RNase (RNase) é unha endonuclease que hidroliza o ARN, cortando principalmente os enlaces fosfodiéster entre nucleótidos.A molécula de RNase é moi estable, hai enlaces disulfuro na estrutura e a súa actividade non require a presenza de catións divalentes, polo que a RNase non se desnaturaliza facilmente e é fácil de renaturalizar mesmo despois de altas temperaturas ou o uso de desnaturalizantes.As RNases divídense en endóxenas e esóxenas.As RNases endóxenas pódense liberar ao mesmo tempo cando se rompen as células.Polo tanto, a eliminación do papel das RNases endóxenas é un paso moi crítico no proceso de extracción de ARN.As RNases exóxenas están amplamente distribuídas.As RNases existen no aire, na pel humana, no cabelo e na saliva, que son razóns importantes para a fácil degradación do ARN.^[3].

Consulta de datos

CANS-CL02-A009 "Aplicación de directrices de acreditación de competencias e calidade dos laboratorios médicos no campo do diagnóstico molecular" nos requisitos técnicos propón que se formulen normas de calidade da auga adecuadas segundo a solicitude;Recipientes herméticos desbotables:

RNase/Clasificación

(1) RNase A

A ribonuclease A (RNase A), derivada do páncreas bovino, é unha endoribonuclease que pode atacar especificamente o extremo 3′ dos residuos de pirimidina do ARN, cortando a citosina ou o uracilo formado por nucleótidos adxacentes.Enlace fosfodiéster, o produto final da reacción é un nucleótido de pirimidina de 3′ e un oligonucleótido cun nucleótido de pirimidina de 3′ ao final.

(2) RNase T1

A ribonuclease T1 (RNase T1) deriva de Aspergillus orjzae, actúa especificamente sobre o fosfato 3′-terminal da guanina, e o sitio de escisión está entre o fosfato 3′ da guanina e o hidroxilo 5′ dos nucleótidos adxacentes.O produto final da reacción é o ácido 3′guanílico e fragmentos de oligonucleótidos con ácido 3′guanílico ao final.

(3) RNase H

A ribonuclease H (RNase H) foi descuberta por primeira vez a partir de tecido de timo de tenreiro, e o seu xene codificador foi clonado en Escherichia coli.Pode degradar especificamente ADN: cadeas de ARN en dúplex híbridos de ARN, dando como resultado oligonucleótidos e mononucleótidos con extremos 3′-OH e 5′-monofosfato, non pode degradar ADN ou ARN monocatenario ou bicatenario.

RNase

Función e uso

A ribonuclease pode catalizar a degradación do ácido ribonucleico (ARN) e pode sintetizarse artificialmente.A pomada medicinal úsase tópicamente para tratar traumas e dor nas articulacións.Segundo os informes, a ribonuclease pode cambiar o metabolismo da célula hóspede, inhibir a síntese de virus, inhibir a proliferación do virus da gripe in vitro e inhibir a formación de virus da vacina e do herpes en embrións de polo.O uso clínico da inxección intramuscular diaria de ribonuclease de 180 mg, beneficioso para o tratamento da encefalite epidémica, a ribonuclease pode catalizar a degradación do ácido ribonucleico (ARN) e agora pode sintetizarse artificialmente.A pomada medicinal úsase tópicamente para tratar traumas e dor nas articulacións.Segundo os informes, a ribonuclease pode cambiar o metabolismo da célula hóspede, inhibir a síntese de virus, inhibir a proliferación do virus da gripe in vitro e inhibir a formación de virus da vacina e do herpes en embrións de polo.O uso clínico da inxección intramuscular diaria de ribonuclease de 180 mg é beneficioso para o tratamento da encefalite epidémica.

RNase

Definición de inhibidor

Definición de unidade inhibidora da RNase: a cantidade de encima necesaria para inhibir o 50% da actividade da 5ng RNase A é unha unidade.

Como funcionan os inhibidores da RNase

Isotiocianato de guanidina:

O isotiocianato de guanidina é un composto orgánico coa fórmula molecular C2H6N4S.Úsase principalmente en medicina biolóxica, reactivos químicos, etc. O isotiocianato de guanidina é un axente lisante de proteínas e úsase a miúdo como compoñente principal da solución de lise nos reactivos de diagnóstico molecular.Pode lisar o tecido, destruír a estrutura celular e disociar o ácido nucleico da nucleoproteína, e ten unha forte desnaturalización da RNase.É o inhibidor da RNase máis eficaz na actualidade.

TRIzol é un novo reactivo de extracción de ARN total que pode extraer directamente o ARN total de células ou tecidos.Contén substancias como fenol e isotiocianato de guanidina, que poden romper rapidamente as células e inhibir as nucleases liberadas polas células.

(Non obstante, o isotiocianato de guanidina é perigoso para a saúde dos investigadores de laboratorio).

RNAsina:

Glicoproteína ácida extraída do fígado de rata ou do blastodermo humano.A rnasina é un inhibidor non competitivo da RNase, que pode unirse a varias RNases para inactivalas.

(Máis detalles: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Htemperatura alta:

A alta temperatura tamén é un medio común de desnaturalización das proteínas.

Pirocarbonato de dietil (DEPC):

A DEPC é un inhibidor da RNase forte pero incompleto, que pode inhibir a actividade da RNase combinándose co anel de aminoácidos imidazol do grupo activo da RNase para desnaturalizar as proteínas.

Complexo de ribonucleósidos de vanadilo:

Un complexo formado por ións de óxido de vanadio e nucleósidos, que se une á RNase en forma de substancias de transición, que poden inhibir case por completo a actividade da RNase.

outra:

SDS, urea, terra de diatomeas, etc. tamén teñen un certo efecto inhibidor sobre a RNase.

Revisións de expertos

Li Yujie Técnico xefe

Director do Departamento de Laboratorio, Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang Afiliado á Universidade de Tongji

Para evitar a biodegradación da RNase esóxena, as máscaras, luvas e sombreiros deben usarse e substituírse con frecuencia durante o proceso de extracción de ARN.Todo o vidro debe cocerse nun forno de secado a 200 °C durante máis de 2 horas.Os materiais utilizados para a cocción, como o plástico, deben ser tratados con auga DEPC e despois lavados con auga destilada.Os reactivos ou dispositivos utilizados para a extracción, conservación e identificación do ARN deberían estar dedicados ao ARN, e debería establecerse unha zona de operación de ARN independente.

referencias:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bacterias e virus na nasofarinxe inmediatamente antes do inicio das infeccións respiratorias agudas inferiores en nenos indíxenas australianos[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Subdivisión de Control de Infeccións Hospitalarias da Asociación China de Medicina Preventiva.Directrices para a recollida e inspección de mostras microbianas clínicas [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018 (20): 3192-3200.

[3] "Proba clínica Ten mil por que volume de proba de bioloxía molecular"