Na fase inicial do brote, debido ao rápido desenvolvemento, o diagnóstico rápido dos pacientes sospeitosos é a clave para previr a COVID-19.Algúns reactivos de detección de ácidos nucleicos aprobados teñen un tempo de desenvolvemento curto e hai problemas como a confirmación do rendemento apresurada, a optimización insuficiente dos reactivos e as grandes diferenzas entre os lotes;Os problemas de varios laboratorios clínicos en varios aspectos do proceso de detección de ácidos nucleicos tamén poden afectar a precisión dos resultados da detección de ácidos nucleicos.Este artigo centrarase nos vínculos e puntos clave na detección actual de ácidos nucleicos SARS-CoV-2 e analizará os problemas de reexame falso negativo e positivo da detección de ácidos nucleicos de laboratorio e a inconsistencia clínica.

Principios de detección de ácidos nucleicos SARS-CoV-2

O SARS-CoV-2 é un virus de ARN cunha secuencia xenómica duns 29 kb, con 10 xenes, que poden codificar efectivamente 10 proteínas.Os virus están compostos por ARN e proteínas, e a capa máis externa é unha capa externa composta por lípidos e glicoproteínas.No seu interior, a cápside da proteína envolve o ARN, protexendo así o ARN facilmente degradable (P1).

P1 Estrutura do SARS-COV-2

Os virus invaden as células a través de receptores específicos da superficie celular para causar infección e usan as células hóspedes para replicarse.

O principio da detección de ácidos nucleicos virales é expor o ARN viral a través dun lisado celular e, a continuación, utilizar a reacción en cadea da polimerase de transcrición inversa fluorescente (RT-PCR) en tempo real para a detección.

A clave do principio de detección é utilizar cebadores e sondas para conseguir a "coincidencia dirixida" das secuencias de ácidos nucleicos, é dicir, atopar a secuencia de ácidos nucleicos do SARS-CoV-2 que é diferente doutros virus nunhas 30.000 bases (a semellanza do ácido nucleico con outros virus) Zona "Baixa"), deseñar cebadores e sondas.

Os cebadores e as sondas están moi combinados coa rexión específica do ácido nucleico SARS-CoV-2, é dicir, a especificidade é moi forte.Unha vez que o resultado da amplificación RT-PCR fluorescente en tempo real da mostra que se vai probar é positivo, proba que o SARS-CoV-2 está presente na mostra.Ver P2.

P2 Pasos da determinación do ácido nucleico SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente en tempo real)

Condicións e requisitos do laboratorio para a detección de ácidos nucleicos SARS-CoV-2

Os laboratorios de probas de ácidos nucleicos son os máis ideais para ambientes de presión negativa e deberían prestar atención ao control da presión, manter o fluxo de aire e eliminar os aerosois.O persoal de probas de ácidos nucleicos debe ter a cualificación correspondente, recibir a formación pertinente sobre reaccións en cadea da polimerase e superar a avaliación.O laboratorio debe estar estrictamente xestionado, zonificado no lugar e o persoal irrelevante está estrictamente prohibido a entrada.A zona limpa debe estar ventilada e desinfectada no lugar.Os elementos relevantes colócanse en zonas, sepáranse limpos e sucios, repóñense a tempo e descontaminanse no lugar.Desinfección rutineira: o desinfectante que contén cloro é a principal solución para áreas máis grandes e pódese usar alcohol cun 75% para áreas pequenas.Unha boa forma de tratar os aerosois é abrir ventás para a ventilación, e tamén se pode realizar a desinfección do aire mediante raios ultravioleta, filtración e desinfección do aire.

Enlaces e parámetros clave da determinación do ácido nucleico SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente en tempo real)

Aínda que os laboratorios en xeral prestan moita atención á "detección de ácidos nucleicos", de feito, a "extracción" de ácidos nucleicos tamén é un dos pasos clave para a detección exitosa, que está intimamente relacionada coa recollida e almacenamento de mostras de virus.

Na actualidade, as mostras respiratorias máis utilizadas, como os hisopos nasofarínxeos, utilizan o segundo método, que é unha solución de inactivación (conservación) preparada a partir da extracción de ácidos nucleicos e solución de lise.Por unha banda, esta solución de preservación do virus pode desnaturalizar a proteína do virus, perder a súa actividade e deixar de ser infecciosa e mellorar a seguridade da fase de transporte e detección;por outra banda, pode romper directamente o virus para liberar o ácido nucleico, eliminar a enzima que descompón o ácido nucleico e evitar o virus.O ARN está degradado.

Unha solución de mostraxe de virus preparada a partir dunha solución de lise de extracción de ácidos nucleicos.Os principais compoñentes son sales equilibradas, axente quelante do ácido etilendiaminotetraacético, sal de guanidina (isotiocianato de guanidina, clorhidrato de guanidina, etc.), tensioactivo aniónico (dodecano) sulfato de sodio), tensioactivo catiónico (oxalato de tetradecil trimetil amonio), fenol, proteína, 8-hidrotiquinolina, varios compoñentes, K8-reihidrothiquinoth.Na actualidade, hai moitos tipos de kits de extracción de ácidos nucleicos e utilízanse diferentes reactivos de extracción e purificación de ácidos nucleicos.Aínda que se utilice o mesmo reactivo de extracción e purificación de ácidos nucleicos, os procedementos de extracción de cada kit son diferentes.

Na actualidade, os produtos do kit de detección de ácidos nucleicos aprobados pola Administración Nacional de Produtos Médicos son seleccionados en función dos xenes ORF1ab, E e N do xenoma SARS-CoV-2.Os principios de detección de diferentes produtos son basicamente os mesmos, pero os seus cebadores e deseños de sondas son diferentes.Hai segmentos de obxectivo único (ORF1ab), segmentos de obxectivo dual (ORF1ab, N ou E) e segmentos de tres obxectivos (ORF1ab, N e E).A diferenza entre detección e interpretación, extracción de ácidos nucleicos e sistema de reacción RT-PCR fluorescente en tempo real debe referirse ás instrucións do kit pertinentes, e recoméndase que os usuarios sigan estrictamente o método de interpretación especificado nas instrucións do kit para a interpretación.As rexións comúns, cebadores e secuencias de sonda amplificadas por RT-PCR fluorescente en tempo real móstranse en P3.

P3 A localización da diana do amplicón SARS-CoV-2 no xenoma e a secuencia de cebadores e sondas

Interpretación dos resultados da determinación do ácido nucleico SARS-CoV-2 (Rcomer-TRT-PCR fluorescente ime)

"Plan de prevención e control da pneumonía para a infección por SARS-CoV-2 (segunda edición)" aclarou por primeira vez os criterios para xulgar os resultados da amplificación dun só xene:

1. Ningún Ct ou Ct≥40 é negativo;

2. Ct<37 é positivo;

3. O valor Ct de 37-40 é a área de escala de grises.Recoméndase repetir o experimento.Se o resultado de refacer Ct<40 e a curva de amplificación ten picos evidentes, a mostra xulgase como positiva, se non, é negativa.

A terceira edición da guía e a cuarta edición da guía continuaron cos criterios anteriores.Non obstante, debido aos diferentes obxectivos empregados nos kits comerciais, a citada 3a edición da guía non daba os criterios para determinar a combinación de obxectivos, facendo fincapé nas instruccións facilitadas polo fabricante.A partir da quinta edición das directrices, aclaráronse dous obxectivos, especialmente os criterios de xuízo para un único obxectivo difícil de xulgar.É dicir, se o laboratorio quere confirmar que un caso é positivo para a detección de ácido nucleico SARS-CoV-2, hai que cumprir 1 de 2 condicións:

(1) Dous obxectivos de SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) na mesma mostra dan positivo mediante RT-PCR fluorescente en tempo real.Se un único obxectivo é positivo, requírese unha nova mostra e unha nova proba.Se os resultados da proba son Se o único obxectivo aínda é positivo, xulgase como positivo.

(2) Dúas mostras de RT-PCR fluorescente en tempo real mostraron un único obxectivo positivo ao mesmo tempo ou dúas mostras do mesmo tipo mostraron un único resultado positivo da proba, que se pode xulgar como positivo.Non obstante, as directrices tamén subliñan que os resultados negativos das probas de ácido nucleico non poden excluír a infección por SARS-CoV-2.Hai que excluír os factores que poden causar falsos negativos, como a mala calidade das mostras (mostras respiratorias da orofarinxe e outras partes), a recollida de mostras demasiado cedo ou demasiado tarde, as mostras non se almacenaron, transportaron e procesaron correctamente e a propia tecnoloxía tivo problemas (variación do virus, inhibición da PCR), etc.

Causas dos falsos negativos na detección do SARS-CoV-2

O concepto de "falso negativo" nas probas de ácidos nucleicos que se refire actualmente, refírese a miúdo a "falsos negativos" nos que os resultados das probas de ácidos nucleicos son inconsistentes coas manifestacións clínicas, é dicir, os síntomas clínicos e os resultados das imaxes son moi sospeitosos de COVID-19, pero as probas de ácidos nucleicos sempre son "negativas" moitas veces.O Centro de Laboratorio Clínico da Comisión Nacional de Saúde explicou a proba de SARS-CoV-2 "falso negativo".

(1) Hai unha certa cantidade de virus nas células da persoa infectada.Os datos existentes mostran que despois de que o corpo sexa infectado polo virus, o virus entra na gorxa polo nariz e a boca, despois na tráquea e os bronquios, e despois chega aos alvéolos.A persoa infectada experimentará o período de incubación, síntomas leves e despois o proceso de síntomas graves e diferentes etapas da enfermidade.E a cantidade de virus presente en diferentes partes do corpo é diferente.

En canto á carga viral dos tipos celulares, células epiteliais alveolares (vías respiratorias inferiores)> células epiteliais das vías respiratorias (vías respiratorias superiores)> fibroblastos, células endoteliais e macrófagos, etc.;do tipo de mostra, líquido de lavado alveolar (o máis Excelente)>esputo de tose profunda> hisopo nasofarínxeo> hisopo orofarínxeo> sangue.Ademais, o virus tamén se pode detectar nas feces.Non obstante, tendo en conta a conveniencia da operación e a aceptación dos pacientes, a orde de mostra clínica de uso común é o hisopo orofarínxeo> hisopo nasofarínxeo> líquido de lavado bronquial (operación complexa) e esputo profundo (xeralmente tose seca, difícil de obter).

Polo tanto, a cantidade de virus nas células da orofarinxe ou nasofarinxe dalgúns pacientes é pequena ou extremadamente baixa.Se só se toman mostras da orofarinxe ou nasofarinxe para a proba, non se detectará o ácido nucleico viral.

(2) Non se recolleron células que conteñan virus durante a recollida de mostras ou non se conservou eficazmente o ácido nucleico viral.

[① Lugar de recollida inadecuado, por exemplo, cando se recollen hisopos orofarínxeos, a profundidade de recollida non é suficiente, os hisopos nasofarínxeos recollidos non se recollen profundamente na cavidade nasal, etc. A maioría das células recollidas poden ser células libres de virus;

②Os hisopos de mostraxe utilízanse incorrectamente.Por exemplo, recoméndase fibras sintéticas como fibra de PE, fibra de poliéster e fibra de polipropileno para o material da cabeza do hisopo.As fibras naturais como o algodón utilízanse no funcionamento real (forte adsorción de proteínas e non é fácil de lavar) e fibras de nailon (mala absorción de auga, que provoca un volume de mostraxe insuficiente);

③Uso incorrecto de tubos de almacenamento de virus, como o mal uso de tubos de almacenamento de plástico de polipropileno ou polietileno que son fáciles de absorber ácidos nucleicos (ADN/ARN), o que resulta nunha diminución da concentración de ácido nucleico na solución de almacenamento.Na práctica, recoméndase utilizar plástico de polímero de polietileno-propileno e algúns envases de plástico de polipropileno tratados especialmente para almacenar ácidos nucleicos virais.]

[① Lugar de recollida inadecuado, por exemplo, cando se recollen hisopos orofarínxeos, a profundidade de recollida non é suficiente, os hisopos nasofarínxeos recollidos non se recollen profundamente na cavidade nasal, etc. A maioría das células recollidas poden ser células libres de virus;

②Os hisopos de mostraxe utilízanse incorrectamente.Por exemplo, recoméndase fibras sintéticas como fibra de PE, fibra de poliéster e fibra de polipropileno para o material da cabeza do hisopo.As fibras naturais como o algodón utilízanse no funcionamento real (forte adsorción de proteínas e non é fácil de lavar) e fibras de nailon (mala absorción de auga, que provoca un volume de mostraxe insuficiente);

③Uso incorrecto de tubos de almacenamento de virus, como o mal uso de tubos de almacenamento de plástico de polipropileno ou polietileno que son fáciles de absorber ácidos nucleicos (ADN/ARN), o que resulta nunha diminución da concentración de ácido nucleico na solución de almacenamento.Na práctica, recoméndase utilizar plástico de polímero de polietileno-propileno e algúns envases de plástico de polipropileno tratados especialmente para almacenar ácidos nucleicos virais.]

(4) O funcionamento do laboratorio clínico non está estandarizado.As condicións de transporte e almacenamento da mostra, o funcionamento normalizado dos laboratorios clínicos, a interpretación dos resultados e o control de calidade son os factores clave para garantir a precisión e fiabilidade dos resultados das probas.Segundo os resultados da avaliación externa da calidade realizada polo Centro de Laboratorio Clínico da Comisión Nacional de Saúde do 16 ao 24 de marzo de 2020, dos 844 laboratorios que recibiron resultados válidos, 701 (83,1%) estaban cualificados e 143 (16,9%) non.Cualificado, as condicións xerais das probas de laboratorio son boas, pero os diferentes laboratorios aínda teñen diferenzas na capacidade de operación do persoal, na capacidade de interpretación de mostras positivas dun só obxectivo e no control de calidade.

Como reducir o falso negativo da detección do ácido nucleico SARS-CoV-2?

A redución de falsos negativos na detección de ácidos nucleicos debería optimizarse desde os catro aspectos da produción de falsos negativos.

(1) Hai unha certa cantidade de virus nas células da persoa infectada.A concentración do virus en diferentes partes do corpo das persoas sospeitosas de estar infectadas será diferente en diferentes momentos.Se non hai farinxe, pode estar no líquido de lavado bronquial ou feces.Se se poden recoller varios tipos de mostras ao mesmo tempo ou en diferentes etapas de progresión da enfermidade para as probas, axudará a evitar falsos negativos.

(2) As células que conteñan virus deben recollerse durante a recollida de mostras.Este problema pódese resolver en gran medida reforzando a formación dos colectores de mostras.

(3) Reactivos IVD fiables.Ao realizar investigacións sobre a avaliación do rendemento de detección de reactivos a nivel nacional e discutir os problemas existentes, pódese mellorar aínda máis a eficiencia de detección dos reactivos e mellorar a sensibilidade da análise.

(4) Funcionamento normalizado dos laboratorios clínicos.Ao fortalecer a formación do persoal do laboratorio, mellorar continuamente o sistema de xestión da calidade do laboratorio, garantir divisións razoables e mellorar a capacidade de detección do persoal, é posible reducir os falsos negativos debido a operacións inadecuadas do laboratorio.

Razóns para o resultado positivo da proba de ácido nucleico SARS-CoV-2 en pacientes recuperados e dados de alta

O "Plan de diagnóstico e tratamento do COVID-19 (ensaio sétima edición)" estipula claramente que un dos criterios para que os pacientes con COVID-19 sexan curados e dados de alta do hospital é que dúas mostras consecutivas das vías respiratorias teñan unha proba de ácido nucleico negativa (polo menos con 24 horas de diferenza), pero hai moi poucos.

(1) O SARS-CoV-2 é un virus novo.É necesario comprender aínda máis o seu mecanismo patóxeno, a imaxe completa da enfermidade causada e as características do curso da enfermidade.Polo tanto, por unha banda, é necesario reforzar a xestión dos pacientes dados de alta e realizar unha observación médica de 14 días.Realizar un seguimento, vixilancia da saúde e orientación sanitaria para afondar na comprensión de todo o proceso de aparición, desenvolvemento e desenlace da enfermidade.

(2) O paciente pode volverse infectar co virus.O académico Zhong Nanshan dixo: Como os pacientes curados teñen anticorpos, o SARS-CoV-2 pode ser eliminado por anticorpos cando invaden de novo.Hai moitas razóns, que poden ser a causa do paciente recuperado, ou poden estar relacionadas coa mutación do virus, ou mesmo a causa das probas de laboratorio.Se se trata do propio virus, a mutación SARS-CoV-2 pode provocar que o anticorpo producido polo paciente recuperado sexa ineficaz contra o virus mutado.Se o paciente se infecta de novo co virus mutado, a proba de ácido nucleico pode volver ser positiva.

(3) En canto aos métodos de proba de laboratorio, cada método de proba ten as súas limitacións.A detección de ácidos nucleicos SARS-CoV-2 débese á elección da secuencia xenética, á composición dos reactivos, á sensibilidade do método e a outras razóns, polo que os kits existentes teñen os seus propios límites de detección inferiores.Despois de que o paciente sexa tratado, o virus no corpo diminúe.Cando a carga viral na mostra que se vai probar está por debaixo do límite inferior de detección, aparecerá un resultado "negativo".Non obstante, este resultado non significa que o virus do corpo desaparecese por completo.O virus pode aparecer despois de deter o tratamento.Rexurdimento”, continúan copiando.Polo tanto, recoméndase revisar unha vez por semana dentro de 2 a 4 semanas despois da alta.

(4) O ácido nucleico é o material xenético do virus.O virus mata despois de que o paciente foi sometido a un tratamento antiviral, pero os fragmentos de ARN viral restantes aínda están retidos no corpo humano e non se descargan completamente do corpo.Ás veces, en determinadas circunstancias, pódese conservar máis.Moito tempo, e neste momento a proba de ácido nucleico será positiva "transitoria".Coa extensión do tempo de recuperación do paciente, despois de que os fragmentos de ARN residuais no corpo se esgotan gradualmente, o resultado da proba de ácido nucleico pode resultar negativo.

(5) O resultado da proba de ácido nucleico do SARS-CoV-2 só proba a presenza ou ausencia de ARN viral e non pode probar a actividade do virus nin se o virus é transmisible.É necesario probar se un paciente que volve ter unha proba de ácido nucleico positiva volverá ser fonte de infección.É necesario levar a cabo un cultivo de virus en mostras clínicas e cultivar un virus "vivo" para demostrar que é infeccioso.

Resumo

En resumo, non se poden evitar por completo os falsos negativos da proba de ácido nucleico SARS-CoV-2, os positivos de repetición e outras condicións que son inconsistentes coas manifestacións clínicas.Na detección e probas reais, recoméndase combinar os síntomas clínicos, os exames de imaxe (TC) e os resultados das probas de laboratorio (proba de ácido nucleico + proba de anticorpos específicos do virus) para un diagnóstico completo para evitar diagnósticos errados e erros.Se os resultados das probas resultan obviamente inconsistentes coas manifestacións clínicas, recoméndase realizar unha análise exhaustiva de toda a ligazón da proba (recollida de mostras, enlaces de circulación e procesamento) para excluír posibles infeccións precoces do virus SARS-CoV-2, infeccións recorrentes ou combinadas con outras infeccións por virus respiratorios, etc.Se as condicións o permiten, recoméndase recoller mostras máis sensibles, como esputo ou fluído de lavado alveolar para reexaminar.

Produtos relacionados:

Kit de detección de ácidos nucleicos SARS-CoV-2 (método de sonda fluorescente PCR múltiple)