A COVID-19 é unha enfermidade infecciosa causada polo coronavirus tipo 2 da síndrome respiratoria aguda grave. Cando unha persoa está infectada, os síntomas máis comúns inclúen febre, tose e falta de aire.

As mostras utilizadas para a proba pódense recoller mediante hisopos nasofarínxeos ou orofarínxeos.

Que é a PCR?

O método estándar de detección de coronavirus é a reacción en cadea da polimerase, PCR.Este é un método moi utilizado en bioloxía molecular.Pode copiar rapidamente millóns a miles de millóns de fragmentos específicos de ADN.

O novo coronavirus contén un xenoma de ARN monocatenario moi longo.Para detectar estes virus mediante PCR, as moléculas de ARN deben converterse nas súas secuencias de ADN complementarias mediante a transcriptase inversa, e despois o ADN recén sintetizado pódese amplificar mediante procedementos estándar de PCR, que se coñecen comunmente como RT-PCR.

Proceso RT-PCR

extracción de ARN

Para realizar este método, basicamente debe extraerse ARN viral.Pódense usar unha variedade de kits de purificación de ARN para unha separación cómoda, rápida e eficaz.

Para extraer ARN viral mediante un kit comercial, primeiro engade a mostra a un tubo de microcentrífuga e despois mestúraa co tampón de lise.Este tampón está altamente desnaturalizado e normalmente consiste en fenol e isotiocianato de guanidina.Ademais, os inhibidores da RNase adoitan estar presentes no tampón de lise para garantir o illamento do ARN viral intacto.

Despois de engadir o tampón de lise, vórtice o tubo de mestura por pulsos e incube a temperatura ambiente.Despois, o virus lisase en condicións altamente desnaturalizantes proporcionadas polo tampón de lise.

Despois de lisar a mostra, úsase un tubo de centrífuga para o procedemento de purificación.A mostra cárgase no tubo de centrífuga e despois centrifúgase.

Este procedemento é un método de extracción en fase sólida no que a fase estacionaria consiste nunha matriz de xel de sílice.

En condicións óptimas de sal e pH, as moléculas de ARN únense á membrana de sílice.

Ao mesmo tempo, elimínanse proteínas e outros contaminantes.

Despois da centrifugación, coloque o tubo de centrífuga nun tubo de recollida limpo, descarte o filtrado e despois engade tampón de lavado.

Coloque o tubo na centrífuga de novo para forzar o tampón de lavado a través da membrana.Isto eliminará todas as impurezas restantes da membrana, deixando só o ARN unido ao xel de sílice.

Despois de lavar a mostra, coloque o tubo nun tubo de microcentrífuga limpo e engade o tampón de elución.

Despois centrifúgase para forzar o tampón de elución a través da membrana.O tampón de elución elimina o ARN viral da columna de spin e obtén ARN purificado libre de proteínas, inhibidores e outros contaminantes.

PASO 2

Concentrado mixto

Despois de extraer o ARN viral, o seguinte paso é preparar a mestura de reacción para a amplificación por PCR.Neste paso, úsase concentrado.Esta solución concentrada é unha solución concentrada premesturada que consiste nunha premestura, transcriptase inversa, nucleótidos, cebador directo, cebador inverso, sonda TaqMan e ADN polimerase.

Finalmente, para completar esta mestura de reacción, engádese a plantilla de ARN.Os tubos mestúranse mediante vórtex de pulso e, a continuación, a mestura de reacción cárgase na placa de PCR.A placa de PCR adoita conter 96 pozos e pode analizar varias mostras ao mesmo tempo.

PASO 3

Amplificación por PCR

A continuación, coloque a placa na máquina de PCR, que é esencialmente un termociclador.

A RT-PCR en tempo real úsase para detectar o novo coronavirus de 2019 amplificando a secuencia diana no xene RdrRP, o xene E e o xene N.A elección do xene diana depende da secuencia do cebador e da sonda.

O primeiro paso da RT-PCR é a transcrición inversa.Sintetizase a primeira cadea de ADN complementario, que é iniciada polo cebador inverso da PCR, que se une á parte complementaria do xenoma do ARN viral.A continuación, a transcriptase inversa engade nucleótidos de ADN ao extremo 3' do cebador para sintetizar ADN complementario ao ARN viral.A temperatura e a duración deste paso dependen dos cebadores, do ARN diana e da transcriptase inversa utilizadas.

A continuación, aplícase un paso inicial de desnaturalización, que resulta na desnaturalización do híbrido ARN-ADN.Este paso é necesario para activar a ADN polimerase.Ao mesmo tempo, a transcriptase inversa está inactivada.

A PCR consiste nunha serie de ciclos térmicos.Cada ciclo consta de etapas de desnaturalización, recocido e extensión.

A etapa de desnaturalización consiste en quentar a cámara de reacción a 95 graos centígrados e utilizala para a desnaturalización do molde de ADN de dobre cadea.

No seguinte paso, a temperatura de reacción redúcese a 58 graos centígrados, permitindo que o cebador directo se asocie á parte complementaria do seu molde de ADN monocatenario.A temperatura de recocido depende directamente da lonxitude e composición da imprimación.

Na etapa de extensión, a ADN polimerase sintetiza unha nova cadea de ADN que é complementaria á cadea de ADN modelo.Engadindo núcleos libres complementarios ao molde na dirección 5′a 3′ da mestura de reacción.A temperatura deste paso depende da ADN polimerase utilizada.

Despois do primeiro ciclo, obtense unha diana de ADN de dobre cadea.

Despois, entra no segundo ciclo.O ADN de dobre cadea é desnaturalizado para producir dúas moléculas de ADN monocatenario.

No seguinte paso, a temperatura de reacción redúcese, os cebadores son recozidos a cada molde de ADN monocatenario e a sonda Taq-man é recozida á parte complementaria do ADN diana.

A sonda TaqMan consiste nun fluoróforo ligado covalentemente ao extremo 5′ da sonda oligonucleótida.Cando é excitado pola fonte de luz do ciclador, o fluoróforo emite fluorescencia.Ademais, a sonda está composta por un quencher no extremo 3′.A proximidade do xene informador ao extintor impide a detección de fluorescencia.

No paso de extensión, a ADN polimerase sintetiza unha nova cadea.Cando a polimerase chega á sonda TaqMan, a súa actividade 5′nuclease endóxena escinde a sonda, separando o colorante do extintor.

Con cada ciclo de PCR, lánzanse máis moléculas de colorante, o que resulta nun aumento da intensidade da fluorescencia proporcional ao número de amplicóns sintetizados.

Este método permite estimar o número dunha secuencia dada presente na mostra.O número de fragmentos de ADN bicatenario duplícase en cada ciclo.Polo tanto, a PCR pódese usar para analizar mostras moi pequenas.

Para medir o sinal fluorescente, a lámpada halóxena de tungsteno, o filtro de excitación, o reflector, a lente, o filtro de emisión e a cámara CCD do dispositivo acoplado á carga.

PASO 4 Detectar

Para medir o sinal fluorescente, a lámpada halóxena de tungsteno, o filtro de excitación, o reflector, a lente, o filtro de emisión e a cámara CCD do dispositivo acoplado á carga.

A luz filtrada da lámpada é reflectida polo reflector, pasa a través da lente do condensador e céntrase no centro de cada burato.A continuación, a fluorescencia emitida polo burato reflíctese polo espello, pasa polo filtro de emisión e é detectada pola cámara CCD.En cada ciclo de PCR, a luz fluoróforo autoexcitada pode ser detectada polo CCD.

Converte a luz captada en datos dixitais.Este método chámase PCR en tempo real e permite un seguimento en tempo real do progreso da reacción de PCR.