Varios inventos revolucionarios na historia da tecnoloxía de detección na miña mente son a tecnoloxía de inmunomarcación baseada no principio da unión específica antíxeno-anticorpo, tecnoloxía PCR e tecnoloxía de secuenciación.Hoxe falaremos da tecnoloxía PCR.Segundo a evolución da tecnoloxía PCR, a xente adoita dividir a tecnoloxía PCR en tres xeracións: tecnoloxía PCR ordinaria, tecnoloxía PCR cuantitativa fluorescente en tempo real e tecnoloxía PCR dixital.
Ctécnica común de PCR
KARY MULLIS (28.12.1944-7.8.2019)
Kary Mullis inventou a reacción en cadea da polimerase (reacción en cadea da polimerase, PCR) en 1983. Dise que cando conducía á súa moza, de súpeto tivo un destello de inspiración e pensou no principio da PCR (sobre os beneficios de conducir).Kary Mullis foi galardoado co Premio Nobel de Química en 1993. O New York Times comentou: "Altamente orixinal e significativo, case dividindo a bioloxía en eras pre-PCR e pos-PCR.
O principio da PCR: baixo a catálise da ADN polimerase, o ADN da cadea nai úsase como molde, e o cebador específico úsase como punto de partida da extensión, e o ADN da cadea filla complementario ao ADN da cadea nai cópiase in vitro mediante desnaturalización, recocido, extensión e outros pasos.É unha tecnoloxía de amplificación de síntese de ADN in vitro, que pode amplificar rápida e específicamente calquera ADN diana in vitro.
Vantaxes da PCR ordinaria
1.Método clásico, estándares internacionais e nacionais completos
2.Menor custo dos reactivos dos instrumentos
3.Os produtos da PCR pódense recuperar para outros experimentos de bioloxía molecular
Máquina de PCR Foregene recomendada: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Produtos relacionados: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Desvantaxes da PCR ordinaria
1.fácil de contaminar
2.operación engorrosa
3.só análise cualitativa
4.Sensibilidade moderada
5.Hai amplificación inespecífica, e cando a banda non específica ten o mesmo tamaño que a banda obxectivo, non se pode distinguir
CPCR baseada en electroforese apilar
En resposta ás deficiencias da PCR común, algúns fabricantes introduciron instrumentos baseados no principio da electroforese capilar.O paso de electroforese despois da amplificación por PCR complétase no capilar.A sensibilidade é maior, e pódese distinguir a diferenza de varias bases e a amplificación pódese calcular por MAERKER.contido do produto.A desvantaxe é que aínda hai que abrir e poñer o produto PCR no instrumento, e aínda hai un gran risco de contaminación.
CapilarEelectroforese
2. Tecnoloxía de PCR cuantitativa fluorescente en tempo real (PCR cuantitativa en tempo real, qPCR)A PCR cuantitativa fluorescente, tamén chamada PCR en tempo real, é unha nova tecnoloxía cuantitativa de ácidos nucleicos desenvolvida por PE (Perkin Elmer) en 1995. O historial de desenvolvemento da PCR cuantitativa fluorescente é unha historia de loitas conmovedoras de xigantes como ABI, Roche e Bio-Rad.Se estás interesado, podes consultalo.Esta técnica é actualmente a técnica de PCR semicuantitativa máis madura e utilizada.
Máquina qPCR recomendada: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Método de tintura fluorescente (SYBR Green I):SYBR Green I é o colorante de unión ao ADN máis usado para a PCR cuantitativa, que se une de forma non específica ao ADN de dobre cadea.No estado libre, SYBR Green emite fluorescencia débil, pero unha vez unido ao ADN de dobre cadea, a súa fluorescencia aumenta 1000 veces.Polo tanto, o sinal fluorescente total emitido por unha reacción é proporcional á cantidade de ADN de dobre cadea presente e aumentará co aumento do produto amplificado.Dado que o colorante se une de forma non específica ao ADN de dobre cadea, pódense xerar resultados falsos positivos.
Produtos relacionados: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Método de sonda fluorescente (tecnoloxía Taqman): DuranteAmplificación por PCR, engádese unha sonda fluorescente específica ao mesmo tempo que un par de cebadores.A sonda é un oligonucleótido lineal, cun grupo indicador fluorescente e un grupo extintor fluorescente marcados respectivamente nos dous extremos.Cando a sonda está intacta, o sinal fluorescente emitido polo grupo informador é absorbido polo grupo extintor e a detección Non hai sinal fluorescente;durante a amplificación da PCR (na fase de extensión), a actividade 5'-3' Dicer do encima Taq dixerirá e degradará a sonda, de xeito que o grupo fluorescente informador e o grupo fluorescente extintor sepáranse, de modo que o sistema de monitorización da fluorescencia pódese recibir o sinal fluorescente, é dicir, cada vez que se amplifica unha cadea de ADN, a molécula de fluorescencia é completa, a acumulación de sinal fluorescente. s e a formación de produtos de PCR.O método de sonda Taqman é o método de detección máis utilizado na detección clínica.
Produtos relacionados: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Vantaxes da qPCR
1.O método está maduro e o equipo de apoio e os reactivos están completos
2.Custo medio dos reactivos
3.doado de usar
4.Alta sensibilidade e especificidade de detección
Desvantaxes da qPCR
A mutación do xene diana leva a que non se detecte.
Non se pode determinar o resultado da detección do modelo de baixa concentración.
Hai un gran erro ao usar a curva estándar para a detección cuantitativa.
3. Tecnoloxía PCR dixital (PCR dixital, dPCR).
A PCR dixital é unha técnica para a cuantificación absoluta de moléculas de ácido nucleico.En comparación coa qPCR, a PCR dixital pode ler directamente o número de moléculas de ADN/ARN, que é a cuantificación absoluta das moléculas de ácido nucleico na mostra de partida.En 1999, Bert Vogelstein e Kenneth W. Kin-zler propuxeron formalmente o concepto de dPCR.
En 2006, Fluidigm foi o primeiro en producir un instrumento comercial de dPCR baseado en chip.En 2009, Life Technologies lanzou os sistemas OpenArray e QuantStudio 12K Flex dPCR.En 2013, Life Technologies lanzou o sistema QuantStudio 3DdPCR, que utiliza tecnoloxía de chip microfluídico a nanoescala de alta densidade para distribuír uniformemente mostras a 20.000 células individuais.ben na reacción.
En 2011, Bio-Rad lanzou o instrumento QX100 dPCR baseado en gotas, que utiliza a tecnoloxía auga en aceite para distribuír uniformemente a mostra a 20.000 gotas de auga en aceite e utiliza un analizador de gotas para analizar as gotas.En 2012, RainDance lanzou o instrumento RainDrop dPCR, impulsado por gas de alta presión, para dividir cada sistema de reacción estándar nunha emulsión de reacción que contén de 1 a 10 millóns de microgotas a nivel de picolitro.
Ata agora, a PCR dixital formou dúas grandes faccións, tipo chip e tipo gotita.Non importa o tipo de PCR dixital, os seus principios fundamentais son a limitación da dilución, a PCR de punto final e a distribución de Poisson.O sistema de reacción de PCR estándar que contén modelos de ácido nucleico divídese uniformemente en decenas de miles de reaccións de PCR, que se distribúen en chips ou microgotas, de xeito que cada reacción contén o máximo posible unha molécula modelo e realízase unha reacción de PCR modelo dunha soa molécula.Mediante a lectura da fluorescencia Cóntase a presenza ou ausencia do sinal e realízase a cuantificación absoluta tras a calibración da distribución estatística de Poisson.
As seguintes son as características de varias plataformas de PCR dixital que usei:
1. Bio-Rad QX200 PCR dixital en gotas Bio-RadQX200 é unha plataforma de PCR dixital moi clásica, o proceso básico de detección: 20.000 mostras son xeradas polo xerador de gotas. As microgotas de auga en aceite son amplificadas nunha máquina de PCR común e, finalmente, o sinal de fluorescencia de cada microgota é lida por un lector de microgotas.A operación é máis complicada, e o risco de contaminación é medio.
PCR dixital de microgotas Xinyi TD1Xinyi TD1 é unha plataforma de PCR dixital doméstica, o proceso de detección básico: xera 30.000-50.000 gotas de auga en aceite a través dun xerador de gotas, amplifica nun instrumento de PCR común e, finalmente, pasa O lector de gotas le o sinal fluorescente de cada gotita.Tanto a xeración de gotas como a lectura nesta plataforma realízanse nun chip dedicado con baixo risco de contaminación.
STILLA Naica PCR dixital con chip micro-gotasSTILLA Naica é unha plataforma de PCR dixital relativamente nova.O proceso básico de detección é: engadir a solución de reacción ao chip, poñer o chip no sistema de xeración e amplificación de microgotas e xerar 30.000 microgotas.Esténdese no chip e complétase a amplificación da PCR no chip.A continuación, o chip amplificado transfírese ao sistema de análise de lectura de microgotas e lese o sinal fluorescente tomando fotografías.Dado que todo o proceso ten lugar nun chip pechado, o risco de contaminación é baixo.
4. PCR dixital con chip 3D ThermoFisher QuantStudio
ThermoFisher QuantStudio 3D é outra plataforma de PCR dixital clásica baseada en chips.O seu proceso básico de detección é: engade a solución de reacción ao espallador e estende a solución de reacción uniformemente no chip con 20.000 micropozos a través do esparcidor., coloque o chip na máquina de PCR para amplificar e, finalmente, coloque o chip no lector e saque unha foto para ler o sinal fluorescente.A operación é relativamente complicada e todo o proceso realízase nun chip pechado e o risco de contaminación é baixo.
5. PCR dixital con chip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity é unha plataforma de PCR dixital de tipo chip relativamente nova.O seu proceso básico de detección é: engadir a solución de reacción ao aplicador e espallar a solución de reacción uniformemente en 10.000 tubos de PCR fixados no tubo de PCR a través do aplicador.No chip microporoso, a solución de reacción entra no chip por acción capilar, e o tubo de PCR co chip colócase na máquina de PCR para a súa amplificación e, finalmente, o chip ponse no lector para ler o sinal fluorescente facendo unha foto.A operación é máis complicada.O risco de contaminación é baixo.
Os parámetros de cada plataforma de PCR dixital resúmense do seguinte xeito:
Os indicadores de avaliación da plataforma de PCR dixital son: o número de unidades divididas, o número de canles fluorescentes, a complexidade da operación e o risco de contaminación.Pero o máis importante é a precisión da detección.Unha forma de avaliar as plataformas de PCR dixitais é utilizar varias plataformas de PCR dixitais para verificarse entre si, e outra forma é utilizar substancias estándar con valores precisos.
Vantaxes da dPCR
1.Conseguir a cuantificación absoluta
2.Maior sensibilidade e especificidade
3.Pode detectar mostras de copia baixa
Desvantaxes da dPCR1. Equipos e reactivos caros 2. Funcionamento complicado e longo tempo de detección 3. Rango de detección estreito
Na actualidade, as tres xeracións de tecnoloxía PCR teñen as súas propias vantaxes e desvantaxes, e cada unha ten os seus propios campos de aplicación, e non é unha relación que unha xeración substitúa á outra.O avance continuo da tecnoloxía inxectou unha nova vitalidade na tecnoloxía PCR, permitíndolle desbloquear unha dirección de aplicación tras outra, facendo que a detección de ácidos nucleicos sexa máis cómoda e precisa.
Fonte: o doutor Yuan lévao a probar
Produtos recomendados:
Hora de publicación: 18-novembro-2022
