1. Detectar a absorbancia da disolución de ARN
A absorbancia a 280, 320, 230 e 260 nm representa os valores de ácido nucleico, fondo (turbidez da solución), concentración de sal e materia orgánica como a proteína, respectivamente.Xeralmente só mira OD260/OD280 (Ratio, R).Cando 1,8~2,0, pensamos que se pode tolerar a contaminación de proteínas ou outras materias orgánicas no ARN, pero hai que ter en conta que cando se usa Tris como tampón para detectar a absorbancia, o valor R pode ser superior a 2 (xeralmente debería ser <2,2).Cando R<1,8, a contaminación da proteína ou doutra materia orgánica na solución é máis evidente e o destino do ARN pódese determinar segundo as necesidades.Cando R>2,2, significa que o ARN foi hidrolizado nun só ácido nucleico.
2.Patrón electroforético do ARN
Xeralmente, o xel desnaturalizante utilízase para a electroforese de ARN, pero se é só para detectar a calidade do ARN, non é necesario o xel desnaturalizante e pódese usar o xel de agarosa común.O propósito da electroforese é detectar a integridade das bandas 28S e 18S e a súa proporción, ou a integridade do frotis de ARNm.Xeralmente, se as bandas 28S e 18S son brillantes, claras e nítidas (referíndose aos bordos das bandas son claras) e o brillo de 28S é máis do dobre que a banda 18S, consideramos que a calidade do ARN é boa.
Os anteriores son os dous métodos que usamos habitualmente, pero ningún destes dous métodos pode indicarnos claramente se hai RNase residual na solución de ARN.Se hai unha cantidade moi pequena de RNase na solución, é difícil para nós detectala co método anterior, pero a maioría das reaccións enzimáticas posteriores realízanse a máis de 37 graos e durante moito tempo.Deste xeito, se hai unha cantidade moi pequena de RNase na solución de ARN, entón haberá un ambiente e un tempo moi axeitados para desempeñar o seu papel nos experimentos posteriores e, por suposto, o experimento estará frío neste momento.A continuación presentamos un método que pode confirmar se hai RNase residual na solución de ARN.
3. Proba de conservación da calor
Segundo a concentración da mostra, extrae dous 1000 ng de ARN da solución de ARN e engádeo a un tubo de centrífuga de 0,5 ml e complétao con tampón Tris de pH 7,0 ata un volume total de 10 ul e, a continuación, sela a tapa do tubo.Poñer un deles nun baño maría a temperatura constante a 70°C e manter quente durante 1 h.A outra parte gardouse nun frigorífico a -20 °C durante 1 h.Cando remate o tempo, retire as dúas mostras para a electroforese.Despois de completar a electroforese, compare as bandas electroforéticas das dúas.Se as bandas dos dous son consistentes ou non teñen diferenzas significativas (por suposto, as súas bandas tamén cumpren as condicións do método 2), significa que non hai contaminación residual da RNase na solución de ARN e que a calidade do ARN é moi boa.Pola contra, se a mostra incubada a 70 °C presenta unha degradación evidente, indica que existe contaminación por RNase na solución de ARN.
2 Métodos e técnicas experimentais de extracción de ARN
Os problemas que adoitamos atopar ao extraer ARN son: (1) O rendemento de ARN é baixo;(2) O ARN ten unha grave contaminación por sal;(3) O ARN ten unha grave contaminación por disolventes orgánicos;(4) degradación da mostra e outros problemas
1. Reactivos de extracción de ARN total de uso habitual
O método de isotiocianato de guanidina e o método de Trizol son os métodos máis utilizados para a extracción de ARN total de tecidos animais e células animais.É especialmente axeitado para pequenas mostras e tecidos que son especialmente difíciles de extraer, como a extracción de ARN total da pel de coello e do tecido conxuntivo animal;ademais, Trizol, como reactivo de lise de propósito xeral, tamén se pode utilizar para a extracción de tecidos vexetais, bacterias, fungos e outros tecidos.Para tecidos vexetais que conteñen polisacáridos e polifenois, como camelia oleifera, follas de té, colza, etc., o método CTAB tamén se pode utilizar para extraer ARN total.
Como método convencional, o método de dobre columna tamén é moi popular debido ao seu funcionamento a temperatura normal, sen necesidade de engadir RNase e seguridade: sen cloroformo, fenois e outros reactivos orgánicos para a extracción.(produtos recomendados )
2. Extracción de ARN total de tecidos animais
(1) Tente escoller tecido fresco, se non é fresco (preferentemente dentro de tres meses - 80 ℃ frigorífico ou conxelado en nitróxeno líquido. Ao cortar o tecido, non corte directamente a temperatura ambiente, asegúrese de Poñelo na caixa de xeo, intente evitar a conxelación e desconxelación repetidas.
(2) Use tesoiras e pinzas limpas para cortar un pequeno anaco de tecido, intente cortar a parte central do tecido ao cortar a mostra ou primeiro corte o anaco grande de tecido do medio e despois corte a mostra na posición de incisión fresca.O tecido eliminado debe estar totalmente triturado, poñer o tecido triturado nun tubo EP sen RNase, engadir o lisado, o tecido triturado debe estar totalmente exposto ao lisado e prepararse para a homoxeneización.
(3) Para tecidos normais, seleccione tecidos do tamaño dun feixón mungo (30-60 mg) para homoxeneizar.Se os tecidos conteñen unha gran cantidade de proteínas, graxa ou tecidos fibrosos densos como o fígado, aumente ou diminúe adecuadamente a cantidade de tecidos cortados (opcional) Escolla 10 ~ 20 mg).
(4) Se se extrae músculo de peixe, carne de camarón, medusa e outros tecidos con alto contido en auga, o volume da mostra debe aumentarse adecuadamente (recomendado 100-200 mg).
(5) Se as condicións o permiten, o tecido animal pódese extraer directamente despois de homoxeneizarse cun homoxeneizador de tecidos de paso alto, se non hai tal equipamento.
(6) O ARN obtido despois da extracción final debe colocarse na caixa de xeo inmediatamente para reducir a degradación do ARN.
3. Extracción de ARN de células animais
(1) Células de suspensión: centrifugar directamente e descartar o medio, lavar con PBS estéril durante 1-2 veces, despois suspender cunha cantidade adecuada de PBS e, a continuación, engadir o lisado para a lise.Non engada o lisado directamente ás células precipitadas despois de descartar completamente o líquido.Isto fará que o paquete de histonas liberado despois de que as células lisadas na capa exterior se adhiran ao exterior das células precipitadas, limitando así o contacto das células do interior do sedimento co lisado., resultando en lise celular incompleta e redución do rendemento de ARN.
(2) Células semi-adherentes ou pouco adheridas: despois de descartar o medio, lave con PBS 1-2 veces, despois absorbe directamente unha cantidade adecuada de PBS e sopra o prato de cultivo cunha pipeta ou pistola para soplar as células e transfiéraas a células sen ARN.Engade o lisado ao tubo EP do encima para a súa extracción.
(3) Células adherentes: primeiro deben ser dixeridas con tripsina, despois recollidas en tubos EP sen RNase, centrifugadas para eliminar o sobrenadante, lavadas 1-2 veces con PBS para eliminar o exceso de tripsina e resuspenderse cunha cantidade adecuada de PBS. A continuación, proceder á etapa de extracción.
4. Extracción de ARN vexetal
Os tecidos vexetais son ricos en compostos fenólicos, ou ricos en polisacáridos, ou conteñen algúns metabolitos secundarios non identificados, ou teñen unha alta actividade da RNase.Estas substancias combínanse estreitamente co ARN despois da lise celular para formar complexos insolubles ou precipitados coloidais, que son difíciles de eliminar.Polo tanto, cando extraemos tecido vexetal, temos que escoller un kit para plantas.O lisado do kit pode resolver eficazmente os problemas de fácil oxidación de polifenois e separación de compostos de polisacáridos e ácidos nucleicos.
(Para a extracción de ARN de plantas polisacáridos de polifenois, produtos recomendados:
(1) A casca, a polpa, as sementes, as follas, etc. da planta deben moerse completamente nun morteiro.Durante o proceso de moenda, o nitróxeno líquido debe repoñerse a tempo para evitar a fusión da mostra.A mostra moída debe engadirse rapidamente ao lisado e axitarse para evitar a degradación do ARN.
(2) Para mostras ricas en fibra, como o arroz e as follas de trigo, a cantidade de extracción debe reducirse adecuadamente, se non, a moenda e lise do tecido non estarán completas, o que resultará nun baixo rendemento de ARN extraído.
(3) Para tecidos vexetais con alto contido en auga, como froitas de Roma, froitas de sandía, froitas de melocotón, etc., o tamaño da mostra debe aumentarse adecuadamente (100-200 mg é opcional).
(4) Os tecidos vexetais, como follas vexetais, rizomas, froitos duros e outros materiais, xeralmente recoméndase usar nitróxeno líquido para mortear completamente os ingredientes nun morteiro e, a continuación, pasar á etapa de extracción.Os homoxeneizadores de tecidos convencionais poden non ser eficaces para homoxeneizar os tecidos vexetais e, polo xeral, non se recomendan.
5. Precaucións para a extracción de ARN
(1) As mostras de tecido deben estar o máis frescas posible para evitar conxelacións e desconxelacións repetidas.
(2) O tecido debe estar totalmente moído durante a extracción e a cantidade de tecido non debe ser demasiado pequena, nin moito menos demasiado.
(3) Débese dar tempo de incubación suficiente despois de engadir o lisado para lisar completamente a mostra.
(4) Cando se usa o método Trizol para a extracción, o principio de absorción do sobrenadante despois da estratificación é "prefire inhalar menos que inhalar máis", e non se debe extraer á capa media, se non, provocará unha grave contaminación do ADN xenómico.
(5) Ao lavar, o líquido de lavado debe infiltrarse completamente ao redor da parede do tubo para garantir un lavado completo.
(6) Para o método de extracción da columna, ademais de separar a columna despois do lavado, a columna de adsorción tamén debe colocarse nun banco ultralimpo e soplar durante 5-10 minutos para evaporar completamente o disolvente orgánico ata secar.
(7) Na última elución do método da columna, despois de engadir auga DEPC, debe incubarse durante 3-5 minutos, ou a auga DEPC debe quentarse a 60 °C con antelación para aumentar o rendemento de elución.No método tradicional de escisión de Trizol e precipitación de isopropanol, o ARN final disólvese en auga DEPC, polo que debe darse un tempo adecuado para a disolución e o fondo do tubo de centrífuga debe soprarse continuamente cunha punta de pipeta.
3 Taquí Causas e solucións para a baixa concentración de ARN/mala calidade
1. O rendemento é demasiado baixo
A mostra extraída é demasiado baixa, a cantidade total é insuficiente ou a mostra extraída é demasiado e a lise non está completa;o tecido ou as células de calidade adecuada deben utilizarse para a extracción, o pretratamento da mostra debe facerse ben e a lise debe ser suficiente.
2. Residuos do xenoma
Ao extraer polo método Trizol, cando o sobrenadante é aspirado na capa media despois da estratificación, provocarase unha grave contaminación do xenoma;débese ter especial coidado ao facer capas para evitar succionar a capa media.Se se usa o método de columna para a extracción, pódese seleccionar un kit que conteña DNase I para a extracción.O ácido nucleico adsorbido na membrana é directamente dixerido coa DNase I, que pode reducir moito os residuos de ADN.
3. Degradación do ARN
Pode ser a degradación da propia mostra extraída, ou a degradación provocada durante o proceso de extracción;na medida do posible, as mostras frescas deben utilizarse para a extracción de ARN, e as mostras recollidas deben almacenarse en nitróxeno líquido ou no frigorífico a -80 °C a tempo, e debe evitarse a conxelación e desconxelación repetidas.No proceso de extracción de ARN deben utilizarse puntas libres de RNase/DNase, tubos de centrífuga e outros materiais.O proceso de extracción debe ser o máis rápido posible.O ARN extraído debe colocarse nunha caixa de xeo e almacenarse a -80 no tempo.Se o ARN extraído debe ser detectado mediante electroforese en xel, a electroforese debe realizarse inmediatamente despois da extracción e o tampón de electroforese debe substituírse por un recentemente preparado.
4. Residuos de sal e disolventes orgánicos
Os reactivos de extracción conteñen fenol e sales de guanidina, e a solución de lavado contén etanol.Durante o proceso de extracción, o lisado non foi completamente absorbido e descartado e a solución de lavado non se secou completamente.As sales residuais e os disolventes orgánicos son prexudiciais para a posterior transcrición inversa e PCR.Diferentes graos de inhibición, polo que o lisado de tecidos debe eliminarse completamente durante o proceso de extracción e o lavado debe ser suficiente para que se poidan lavar as paredes circundantes do tubo.Ademais, o tubo é baleirado e soprado é un paso necesario, o que reducirá aínda máis o residuo de materia orgánica.
Para obter máis información sobre a extracción de ARN, siga o noso sitio web:
www.foreivd.com para máis información.
Hora de publicación: Dec-01-2022
