A PCR directa é unha reacción que utiliza directamente tecidos animais ou vexetais para a amplificación sen extracción de ácido nucleico.En moitos sentidos, a PCR directa funciona como a PCR normal

A principal diferenza é o tampón personalizado usado na PCR directa, a mostra pode ser sometida directamente á reacción de PCR sen extracción de ácido nucleico, pero hai requisitos correspondentes para a tolerancia das encimas e a compatibilidade do tampón implicado na reacción de PCR directa.

Aínda que hai máis ou menos inhibidores da PCR nas mostras comúns, a PCR directa aínda pode conseguir unha amplificación fiable baixo a acción de encimas e tampóns.A reacción de PCR tradicional require ácido nucleico de alta calidade como molde, que pode inhibir o progreso suave da reacción de PCR se o molde contén proteínas e outras impurezas.A PCR directa é actualmente unha das tecnoloxías máis populares no campo do diagnóstico molecular.

01 A PCR directa utilizouse orixinalmente para animais e plantas

A aplicación máis antiga da PCR directa é no campo de animais e plantas, como o sangue, tecidos e cabelos de ratas, gatos, galiñas, coellos, ovellas, gando, etc., follas e sementes de plantas, etc., usados ​​para estudar xenotipado, transxénicos, detección de plásmidos, análise de eliminación xenética, identificación de fontes de ADN, análise de especies e outros campos de identificación SNP.

Estes campos teñen algunhas características comúns, é dicir, o contido do xene obxectivo é relativamente alto e a extracción de ácidos nucleicos é problemática, polo que a PCR directa non só pode aforrar tempo e ter un pequeno impacto nos resultados, senón tamén aforrar custos.

A PCR directa utilizada para a detección de patóxenos é unha cuestión dos últimos anos, algúns fabricantes de reactivos de PCR fixeron moitos esforzos nesta dirección ao facer innovación.Especialmente nesta epidemia de COVID-19, apareceron no mercado moitos destes produtos de detección, como o Kit de detección de ácidos nucleicos SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) investigado e desenvolvido por Foregene, que utiliza a tecnoloxía RT PCR en tempo real (rRT-PCR) para a detección cualitativa de mostras de ácidos nucleicos nasal-2 ou de swarcofaxia humana. s.

Foregene é unha das empresas que usa a tecnoloxía Direct PCR, para a detección de ORF1ab, N, E evariante liñaxes ácidos nucleicos en mostras nasofarínxeas ou orofarínxeas humanas como o SARS-CoV-2 liñaxe B.1.1.7 (Reino Unido), liñaxe B.1.351 (ZA), liñaxe B.1.617 (IND) e liñaxe P.1 (BR).

02  Reactivos necesarios para a PCR directa

Lisado de mostra

O lisado de mostra pódese configurar por ti mesmo ou compralo.A diferenza na composición de diferentes marcas de lisado fará que a capacidade de lisado sexa diferente, e entón o tempo de lisado será lixeiramente diferente.Por exemplo, para a preparación de mostras de tecido animal, recoméndase xeralmente 30 minutos ou a lise durante a noite, e a solución de lise para virus varía entre 3 e 10 minutos.

Mix master PCR

Recoméndase utilizar ADN polimerase de inicio en quente para mellorar a amplificación específica e aumentar a capacidade de amplificación.O núcleo da PCR directa é unha polimerase altamente tolerante.

Eliminar ou inhibir os compoñentes da mostra que afectan á amplificación do ADN

Despois de que a mostra sexa procesada co lisado, liberaranse proteínas, lípidos e outros restos celulares, estas substancias inhibirán a reacción de PCR.Polo tanto, a PCR directa require a adición da eliminación ou inhibidores correspondentes para reducir a influencia destes factores.

03  Unha colección de cinco puntos de coñecemento da PCR directa

En primeiro lugar, a tecnoloxía de PCR directa é unha tecnoloxía de PCR directa para varias mostras biolóxicas.Baixo esta condición técnica, non hai necesidade de separar e extraer o ácido nucleico, usar directamente a mostra de tecido como obxecto e engadir os cebadores do xene diana para realizar a reacción de PCR.

En segundo lugar, a tecnoloxía de PCR directa non só é unha tecnoloxía tradicional de amplificación de moldes de ADN, senón que tamén inclúe a PCR de transcrición inversa do modelo de ARN.

En terceiro lugar, a tecnoloxía Direct PCR non só realiza directamente reaccións de PCR cualitativas rutineiras en mostras de tecido, senón que tamén inclúe reaccións qPCR en tempo real, o que require que o sistema de reacción teña unha forte capacidade de interferencia de fluorescencia anti-fondo e que a fluorescencia endóxena extinga a capacidade antagónica.

En cuarto lugar, as mostras dirixidas á tecnoloxía Direct PCR só necesitan a liberación de modelos de ácidos nucleicos, e non eliminan proteínas, polisacáridos, ións salinos, etc. que interfiran coa reacción da PCR.O que require que a polimerase de ácido nucleico e a mestura de PCR do sistema de reacción teñan unha excelente resistencia e adaptabilidade para garantir a actividade enzimática e a precisión da replicación en condicións complexas.

En quinto lugar, a mostra de tecido dirixida pola tecnoloxía Direct PCR sen ningún tratamento de enriquecemento de ácidos nucleicos e a cantidade de molde é moi pequena, o que require que o sistema de reacción teña unha sensibilidade e unha eficiencia de amplificación extremadamente altas.